53 Pewarna tryphan blue bubuk sebanyak 0.05 gram dilarutkan
dengan 20 ml PBS. Setelah diaduk sampai homogen, larutan pewarna tersebut dilewatkan melalui membran filter steril 0.2 µm.
6. Pengujian Proliferasi Sel Limfosit a. Isolasi Limfosit Fisher et al., 1998
Darah dari dalam syringe dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse steril kemudian disentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm
selama 10 menit. Bagian tengah lapisan buffycoat yang berisi sel-sel limfosit diambil perlahan-lahan dengan pipet pasteur kemudian
ditambahkan 3 ml media RPMI-1640. Histopaque dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, kemudian
diletakkan perlahan-lahan campuran lapisan buffycoat dan media RPMI-1640 di atasnya dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya
disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit. Hasil sentrifuse didapatkan lapisan putih seperti cincin antara histopaque dan
RPMI-1640. Lapisan putih diambil dengan pipet pasteur ke dalam tabung
ssntrifuse dan ditambahkan 5 ml RPMI-1640, kemudian disentrifuse dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, lalu
pada bagian pelet ditambahkan RPMI-1640 dan disentrifuse kembali dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Pencucian limfosit ini
dilakukan dua kali sehingga diperoleh kemurnian suspensi sel limfosit yang tinggi.
b. Penghitungan Sel Limfosit Fisher et al., 1998
Sebelum dilakukan kultur sel limfosit, terlebih dahulu dilakukan penghitungan sel limfosit secara manual dengan menggunakan pewarna
tryphan blue. Sebanyak 50 µl suspensi sel limfosit ditempatkan ke dalam sumur microplate dan ditambahkan 50 µl tryphan blue ke
dalamnya. Penghitungan sel limfosit dilakukan dengan menggunakan hemasitometer di bawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali.
54 Jumlah sel limfosit yang dapat dihitung harus lebih besar dari
95 berupa sel limfosit hidup yang berwarna terang. Limfosit yang diperoleh akan digunakan untuk analisis proliferasi sel B dan sel T.
Penghitungan sel limfosit dengan hemasitometer dapat dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
N = A x FP x 10
4
selml Keterangan : N = jumlah sel limfositml
A = jumlah sel hidup rata-rata per kotak 0.1 mm
3
FP = faktor pengenceran
c. Proliferasi Sel Limfosit dengan Metode MTT Mosmann, 1983
Jumlah sel limfosit dari masing-masing responden ditepatkan menjadi 2 x 10
6
selml dengan media sintetik RPMI-1640. Ke dalam tiap sumur microplate dimasukkan 100 µl suspensi sel dari masing-
masing responden. Kemudian ditambahkan masing-masing ke dalam sumur, 80 µl larutan mitogen Concanavalin A 25 µgml untuk
pengujian proliferasi sel T atau 80 µl larutan mitogen LPS Salmonella Typhosa 25 µgml untuk pengujian proliferasi sel B, sehingga diperoleh
konsentrasi dalam kultur 10 µgml konsentrasi Con A dan LPS di tiap- tiap sumur. Sebagai kontrol hanya ditambahkan 80 µl media RPMI-
1640, tanpa penambahan mitogen. Selanjutnya ditambahkan ke masing- masing sumur 20 µl FBS sehingga volume total tiap sumur berisi 200 µl
kultur. Kultur diinkubasi selama 48 jam dalam inkubator bersuhu 37
o
C dengan kandungan atmosfer yang mengandung 5 CO
2
dan RH 95. Pengujian aktivitas proliferasi sel limfosit ini dilakukan dengan
menggunakan metode MTT. Sebelum masa inkubasi berakhir, 6 jam sebelumnya, ke dalam masing-masing sumur ditambahkan 10 µl MTT
dengan konsentrasi 0.5 dan diinkubasi kembali pada kondisi yang sama selama 6 jam. Pada akhir masa inkubasi, ditambahkan 80 µl HCl-
isopropanol 0.04 N, setelah itu dilakukan pembacaan sel dengan alat
55 microplate reader pada panjang gelombang 570 nm. Nilai indeks
stimulasi IS dapat dihitung dengan persamaan seperti berikut ini :
IS = kontrol
sel OD
mitogen perlakuan
sel OD
7. Analisis Statistik
