45 Beberapa jenis mitogen yang digunakan untuk menstimulir
aktivitas proliferasi sel limfosit adalah pokeweed PWM, fitohemoglutinin PHA, concanavalin A Con A, dan lipopolisakarida
LPS bakteri Garam negatif. Terdapat sejumlah mitogen yang hanya dapat mengaktivasi sel limfosit B atau sel limfosit T saja, dan ada pula yang
dapat mengaktivasi populasi keduanya. Pokeweed merupakan jenis mitogen yang mampu mengaktivasi kedua jenis sel limfosit B dan T.
Mitogen PHA dan Con A dapat merangsang transformasi blast subpopulasi sel T. Sementara LPS akan bereaksi dengan membran plasma
sel B dan menghasilkan aktivitas seluler.
F. Metode Pewarnaan MTT MTT Assay
MTT assay merupakan salah satu metode kolorimetri pewarnaan menggunakan pewarna MTT dengan mengukur konsentrasi warna nilai
absorbansi produk akhir yang terbentuk menggunakan spektrofotometer. MTT yang memiliki nama kimia [3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-
diphenyltetrazolium bromide] merupakan garam tetrazolium yang dapat bereaksi secara in vitro dengan enzim suksinat dehidrogenase yang dihasilkan
oleh sel hidup Mosmann, 1983. Enzim suksinat dehidrogenase adalah salah satu enzim yang berperan
aktif selama proses respirasi seluler secara aerobik. Enzim suksinat dehidrogenase merupakan flavoprotein yang mengandung protein dengan
ikatan Fe besi dan S belerang. Enzim ini terikat pada bagian membran mitokondria yang berfungsi sebagai reduktor selama tahapan siklus Krebs
dan transpor elektron. Pada siklus Krebs, enzim ini menerima hidrogen dari suksinat dan bertugas menghidrogenasi suksinat menjadi fumarat serta
menghasilkan FADH
2
. FADH
2
yang dibentuk akan mengalami reoksidasi pada rantai transpor elektron yang berkaitan erat dengan pembentukan energi
ATP dalam proses fosforilasi oksidatif Lehninger, 1982. Prinsip metode pewarnaan MTT adalah mereduksi garam
monotetrazolium yang berwarna kuning dan larut dalam air oleh enzim suksinat dehidrogenase yang diproduksi oleh sel hidup menjadi produk akhir
46 kristal biru formazan yang tidak larut air yang kemudian diukur kepekatan
warna biru yang terbentuk dengan menggunakan microplate reader. Pemecahan MTT menjadi formazan dilakukan oleh enzim suksinat
dehidrogenase di bagian mitokondria sel yang hidup. Absorbansi yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi kristal formazan yang
terbentuk. Nilai absorbansi tersebut memiliki korelasi positif terhadap jumlah sel yang hidup Liu et al., 1997.
Menurut Freimoser et al. 1999, MTT assay merupakan metode uji viabilitas sel kuantitatif yang lebih praktis, cepat, dan efisien dengan hasil
yang cukup akurat dibandingkan dengan menggunakan metode pewarnaan tryphan blue yang dilakukan secara manual pada pengujian sel fungi. Reduksi
garam tetrazolium merupakan cara yang dapat dipercaya untuk mendeterminasi proliferasi sel limfosit. Garam tetrazolium MTT yang
berwana kuning berkurang sebagai akibat proses metabolisme sel, terutama karena aktivitas kerja enzim suksinat dehidrogenase. Kristal formazan tidak
larut air berwarna biru tua yang terbentuk dapat dilarutkan dengan pelarut organik, seperti isopropanol, etil asetat, dietil eter, atau n-butanol, dan
kemudian diukur dengan alat spektrofotometer. Perubahan MTT yang awalnya berwarna kuning menjadi warna biru
tua menandakan adanya sel hidup yang mengeluarkan enzim suksinat dehidrogenase dan mereduksi pewarna MTT tersebut. Pada sel mati yang
seluruh proses metabolismenya terhenti dan tidak dapat memproduksi enzim yang dapat mereduksi pewarna MTT, tidak menghasilkan produk akhir
formazan sehingga tidak merubah warna kuning garam tetrazolium. Perubahan warna yang terjadi kemudian diukur absorbansinya menggunakan
alat microplate reader pada panjang gelombang 570 nm. Reaksi reduksi pewarna MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase yang dihasilkan sel hidup
dapat dilihat pada Gambar 3.
47 Gambar 3. Reaksi reduksi pewarna MTT menjadi formazan Prosecus, 2006
Kandungan enzim suksinat dehidrogenase relatif konstan di antara berbagai sel dengan tipe spesifik sehingga jumlah formazan yang dihasilkan
dapat dipercaya berbanding lurus terhadap jumlah sel. Pengujian jumlah proliferasi sel limfosit manusia menggunakan MTT assay dengan mengukur
nilai absorbansi yang akan digunakan untuk mendapatkan nilai indeks stimulasi IS. Metode ini sering digunakan untuk mengukur proliferasi sel
dan toksisitas sel. Semakin tinggi absorbansi maka semakin tinggi pula nilai indeks stimulasi yang menandakan semakin banyak jumlah sel limfosit yang
hidup. Sebaliknya, semakin rendah absorbansi maka semakin rendah indeks stimulasi yang berarti semakin banyak sel limfosit yang mati.
48
III. METODOLOGI PENELITIAN A. Bahan dan Alat
1. Bahan
Bahan utama yang digunakan di dalam penelitian ini adalah air minum penambah oksigen. Sampel air minum penambah oksigen yang
digunakan terdiri dari tiga konsentrasi, yaitu 0, 80, dan 130 ppm. Sampel air minum penambah oksigen 10 ppm sama dengan air minum biasa. Air
minum penambah oksigen berasal dari PT. Royal Kekaltama Beverages RK Beverages, Sukabumi.
Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk isolasi dan proliferasi sel limfosit manusia adalah EDTA 1, alkohol 70, histopaque
SIGMA, media RPMI-1640 SIGMA yang telah mengandung L-glutamin, NaHCO
3
, Phosphat Buffer Saline SIGMA, antibiotik gentamisin SIGMA, Concanavalin A SIGMA, lipopolisakarida
Salmonella Typhosa SIGMA, Fetal Bovine Serum GIBCO, tryphan blue, HCl-isopropanol, aquabidest, aquadest, dan garam MTT [3-4,5-
dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide] SIGMA. Bahan utama yang digunakan adalah sel limfosit manusia yang
diisolasi dan berasal dari darah sukarelawan responden. Responden tersebut terdiri dari 25 mahasiswa Departemen Ilmu dan Teknologi
Pangan, Institut Pertanian Bogor.
2. Alat
Alat-alat yang digunakan di dalam penelitian, antara lain oxygen meter dari laboratorium QC RK Beverages, syringe 20 ml Terumo,
pipet pasteur steril, pipet serological Falcon, tabung sentrifuse steril 15 ml dan 50 ml Falcon, mikropipet, tabung vial kecil, mikrotip,
microplate steril dengan 96 sumur Nunc, membran filter steril 0.2 µm Sartorius, pipet Mohr steril 5 dan 10 ml, sentrifuse, laminar flow cabinet,
hemasitometer Superior, cell counter, mikroskop, inkubator kondisi CO
2
5, RH 95, dan suhu 37
o
C, dan microplate reader Bio-Rad.
