50 untuk menandatangani MoU Memorandum of Understanding yang
menyatakan bahwa responden bersedia melakukan kewajiban yang diminta selama penelitian berlangsung. Beberapa hal yang tercantum
dalam MoU tersebut, antara lain jaminan keamanan air minum sebagai objek penelitian utama. Di samping itu juga berisi pernyataan kesediaan
responden untuk melaksanakan segala ketentuan yang diberlakukan kepada responden sampai dengan proses pengambilan darah setelah
intervensi selesai, yaitu selama 12 hari. Intervensi sampel dilakukan kepada semua responden pada masing-
masing kelompok. Intervensi dilakukan dengan cara mengkonsumsi sampel air minum penambah oksigen sebanyak dua kali sehari, yaitu
setelah sarapan dan makan siang selama 12 hari. Setiap konsumsi, responden diharuskan untuk menghabiskan satu botol sampel air minum
penambah oksigen yang berisi sebanyak 385 ml. Responden penelitian ini merupakan mahasiswa Departemen ITP yang sedang melakukan penelitian
sebagai tugas akhir di kampus IPB, oleh karena itu pelaksanaan intervensi sampel air minum penambah oksigen untuk masing-masing kelompok
dilakukan di lingkungan kampus. Sampel air minum diberi kode tertentu sehingga tiap-tiap responden tidak mengetahui jenis sampel yang
diminumnya blind sample. Air minum tersebut harus dihabiskan sekaligus pada waktu itu juga tanpa bersisa sedikitpun untuk memastikan
oksigen terlarut yang masuk bersamaan dengan air minum.
3. Proses Pengambilan Darah
Pengambilan darah dilakukan dua kali, yaitu sebelum dan sesudah intervensi pemberian sampel air minum. Proses tersebut dilaksanakan di
laboratorium klinik Caritas, Bogor oleh tenaga medis yang ahli dan berpengalaman.
Darah diambil secara steril dari masing-masing responden dengan menggunakan syringe 20 ml yang telah mengandung larutan EDTA 1
yang berfungsi sebagai antikoagulan. Kemudian darah tersebut digunakan
51 untuk penelitian lebih lanjut, yaitu isolasi dan proliferasi limfosit dengan
menggunakan metode pewarnaan MTT.
4. Persiapan Ruang Kerja dan Laminar Flow Cabinet Steril
Sebelum melakukan kerja steril, ruangan dan laminar flow cabinet disterilkan terlebih dahulu. Ruang kerja disterilkan dengan proses
pengasapan KMNO
4
. Sebelum dilakukan pengasapan, dipastikan ruangan tertutup rapat dan tidak ada celah yang kontak langsung dengan udara luar.
Ruangan diasapi dengan menggunakan KMNO
4
bubuk sebanyak 167 gram dan larutan formaldehida 40 sebanyak 1000 ml yang
ditempatkan ke dalam wadah lalu dipanaskan sampai terbentuk asap dan didiamkan selama 3 hari tanpa dimasuki oleh siapapun. Proses ini
dilakukan untuk mengilangkan kontaminan bakteri dan virus yang berada di udara dalam ruangan yang dapat mengkontaminasi aktivitas penanganan
sel limfosit di dalam ruang kerja. Pensterilan laminar flow cabinet dilakukan dengan cara penyinaran
sinar UV selama 15 menit setiap akan digunakan dan juga penyemprotan alkohol 70 pada permukaan meja laminar flow cabinet. Hal tersebut juga
berlaku untuk peralatan yang akan digunakan selama pengerjaan isolasi dan proliferasi limfosit di dalam laminar flow cabinet. Cara menjaga
kesterilan laminar flow cabinet adalah dengan mengaliri udara laminar di dalamnya untuk mencegah kontaminasi dengan udara luar.
5. Pembuatan Larutan Pereaksi dan Media Kultur Sel Mosmann, 1983
Pembuatan media dan tahap-tahap selanjutnya dalam analisis limfosit dilakukan di dalam laminar flow cabinet yang steril dan dialiri
oleh udara laminar. Sebelum digunakan, ruangan dan peralatan disinari terlebih dahulu dengan sinar UV selama 15 menit.
a. Persiapan Media Kultur Sel Limfosit
Media yang digunakan untuk kultur dan pemeliharaan sel limfosit berupa 10.42 gram RPMI-1640 bubuk yang telah mengandung
52 L-glutamin. Bubuk tersebut dilarutkan dengan aquabidest steril
sehingga diperoleh 1 liter larutan RPMI-1640. Kemudian ditambahkan 2 gram NaHCO
3
dan 1 antibiotik gentamisin. Larutan yang sudah bercampur disterilisasi dengan membran filter 0.2 µm steril, maka
didapatkan larutan RPMI-1640 steril yang digunakan untuk isolasi sel limfosit. Untuk media pertumbuhan dan pemeliharaan sel limfosit
digunakan media larutan RPMI-1640 di atas dengan penambahan fetal bovine serum FBS 10 steril.
b. Pembuatan Larutan MTT 0.5
Sebesar 0.05 gram garam MTT bubuk dicampurkan dengan PBS sebanyak 10 ml. Kemudian larutan pewarna liquid yang telah homogen
tersebut disterilkan dengan melewatkan larutan MTT ke dalam membran fiter steril berukuran 0.2 µm.
c. Pembuatan Larutan Phosphate Buffer Saline PBS
Satu sachet PBS bubuk dengan pH 7.4 dilarutkan dalam 1 liter aquabidest. Setelah itu, larutan PBS dilewatkan melalui membran steril
berukuran 0.2 µm sehingga didapatkan larutan yang steril. Komposisi PBS terdiri dari NaCl, KCl, KH
2
PO4, Na
2
HPO4, serta Na
2
HPO4.2H
2
O.
d. Pembuatan Larutan HCl-Isopropanol 0.04 N
Sebanyak 23.4 µm HCl pekat 37 p.a dipipet dan ditambahkan dengan isopropanol p.a 8.9766 ml. Setelah itu larutan
diaduk sampai homogen dan siap digunakan. Larutan ini baru dibuat jika akan digunakan saja dan tidak dapat disimpan.
e. Pembuatan Larutan Tryphan Blue 0.2
53 Pewarna tryphan blue bubuk sebanyak 0.05 gram dilarutkan
dengan 20 ml PBS. Setelah diaduk sampai homogen, larutan pewarna tersebut dilewatkan melalui membran filter steril 0.2 µm.
6. Pengujian Proliferasi Sel Limfosit a. Isolasi Limfosit Fisher et al., 1998
Darah dari dalam syringe dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse steril kemudian disentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm
selama 10 menit. Bagian tengah lapisan buffycoat yang berisi sel-sel limfosit diambil perlahan-lahan dengan pipet pasteur kemudian
ditambahkan 3 ml media RPMI-1640. Histopaque dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, kemudian
diletakkan perlahan-lahan campuran lapisan buffycoat dan media RPMI-1640 di atasnya dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya
disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit. Hasil sentrifuse didapatkan lapisan putih seperti cincin antara histopaque dan
RPMI-1640. Lapisan putih diambil dengan pipet pasteur ke dalam tabung
ssntrifuse dan ditambahkan 5 ml RPMI-1640, kemudian disentrifuse dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, lalu
pada bagian pelet ditambahkan RPMI-1640 dan disentrifuse kembali dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Pencucian limfosit ini
dilakukan dua kali sehingga diperoleh kemurnian suspensi sel limfosit yang tinggi.
b. Penghitungan Sel Limfosit Fisher et al., 1998
Sebelum dilakukan kultur sel limfosit, terlebih dahulu dilakukan penghitungan sel limfosit secara manual dengan menggunakan pewarna
tryphan blue. Sebanyak 50 µl suspensi sel limfosit ditempatkan ke dalam sumur microplate dan ditambahkan 50 µl tryphan blue ke
dalamnya. Penghitungan sel limfosit dilakukan dengan menggunakan hemasitometer di bawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali.
54 Jumlah sel limfosit yang dapat dihitung harus lebih besar dari
95 berupa sel limfosit hidup yang berwarna terang. Limfosit yang diperoleh akan digunakan untuk analisis proliferasi sel B dan sel T.
Penghitungan sel limfosit dengan hemasitometer dapat dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
N = A x FP x 10
4
selml Keterangan : N = jumlah sel limfositml
A = jumlah sel hidup rata-rata per kotak 0.1 mm
3
FP = faktor pengenceran
c. Proliferasi Sel Limfosit dengan Metode MTT Mosmann, 1983
Jumlah sel limfosit dari masing-masing responden ditepatkan menjadi 2 x 10
6
selml dengan media sintetik RPMI-1640. Ke dalam tiap sumur microplate dimasukkan 100 µl suspensi sel dari masing-
masing responden. Kemudian ditambahkan masing-masing ke dalam sumur, 80 µl larutan mitogen Concanavalin A 25 µgml untuk
pengujian proliferasi sel T atau 80 µl larutan mitogen LPS Salmonella Typhosa 25 µgml untuk pengujian proliferasi sel B, sehingga diperoleh
konsentrasi dalam kultur 10 µgml konsentrasi Con A dan LPS di tiap- tiap sumur. Sebagai kontrol hanya ditambahkan 80 µl media RPMI-
1640, tanpa penambahan mitogen. Selanjutnya ditambahkan ke masing- masing sumur 20 µl FBS sehingga volume total tiap sumur berisi 200 µl
kultur. Kultur diinkubasi selama 48 jam dalam inkubator bersuhu 37
o
C dengan kandungan atmosfer yang mengandung 5 CO
2
dan RH 95. Pengujian aktivitas proliferasi sel limfosit ini dilakukan dengan
menggunakan metode MTT. Sebelum masa inkubasi berakhir, 6 jam sebelumnya, ke dalam masing-masing sumur ditambahkan 10 µl MTT
dengan konsentrasi 0.5 dan diinkubasi kembali pada kondisi yang sama selama 6 jam. Pada akhir masa inkubasi, ditambahkan 80 µl HCl-
isopropanol 0.04 N, setelah itu dilakukan pembacaan sel dengan alat
55 microplate reader pada panjang gelombang 570 nm. Nilai indeks
stimulasi IS dapat dihitung dengan persamaan seperti berikut ini :
IS = kontrol
sel OD
mitogen perlakuan
sel OD
7. Analisis Statistik
Pengujian penelitian konsumsi air minum penambah oksigen ini dilakukan dengan membandingkan nilai indeks stimulasi IS proliferasi
sel limfosit B dan T setelah intervensi IS akhir dan sebelum intervensi IS awal. Pengujian ini dilakukan pada responden kelompok 1 10 ppm,
2 80 ppm, dan kelompok 3 130 ppm. Pengukuran nilai IS awal adalah sebelum intervensi dan pengukuran nilai IS akhir 12 hari setelah intervensi
pada responden manusia. Analisis statistik terhadap nilai IS sebelum dan sesudah menggunakan analisis sidik ragam Paired Sample T-Test untuk
menentukan perbedaan nyata pada taraf uji 5.
56
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Kadar Oksigen Terlarut di dalam Botol
Kandungan standar oksigen terlarut di dalam botol air minum penambah oksigen adalah 80 ppm. Pada penelitian ini dilakukan pengujian air
minum penambah oksigen 10 ppm, 80 ppm dan 130 ppm untuk mengetahui pengaruh yang ditimbulkan terhadap proliferasi sel limfosit manusia. Di
dalam penelitian ini dilakukan pula pengujian terhadap air minum penambah oksigen dengan kadar oksigen terlarut 130 ppm selama 24 jam dengan
beberapa perlakuan. Pengujian tersebut dilakukan untuk mengetahui penurunan kadar oksigen terlarut selama masa penyimpanan. Dengan
demikian pihak produsen berupaya untuk menjamin klaim produk air minum penambah oksigen yang mengandung tidak kurang dari 80 ppm oksigen
terlarut di dalam kemasannya. Selama masa penyimpanan terdapat beberapa faktor yang dapat
menyebabkan terjadinya penurunan oksigen terlarut. Kemungkinan botol kemasan yang terpapar sinar matahari secara langsung akan menyebabkan
oksigen akan mudah menguap. Kemungkinan lain terjadi benturan atau goncangan di dalam botol yang dapat menurunkan konsentrasi oksigen di
dalam air. Penanganan produk pada saat di tangan konsumen juga ikut berpengaruh terhadap kadar oksigen terlarut dalam botol. Ada berbagai
macam cara yang dilakukan konsumen selama mengkonsumsi air minum penambah oksigen ini yang menyebabkan menurunnya kadar oksigen terlarut,
seperti membuka tutup botol terlalu lama sebelum meminum produk, mengkonsumsi produk tidak langsung habis tetapi dilakukan berkali-kali,
serta meminum produk langsung ke mulut dengan posisi miring. Pengukuran kadar oksigen terlarut dilakukan untuk mengetahui
kestabilan jumlah oksigen terlarut yang terkandung di dalam botol air minum penambah oksigen pada selang waktu dan keadaan tertentu. Adapun hasil
pengukuran menunjukkan bahwa kadar oksigen terlarut cenderung menurun dari waktu ke waktu dengan beberapa jenis perlakuan, yaitu dimiringkan,
dibuka lalu ditutup, dan yang dibiarkan terbuka. Hasil pengukuran kadar
