3. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juli 2011 di Laboratorium Biokimia Pangan dan Kimia Pangan Departemen Ilmu Teknologi
Pangan, Institut Pertanian Bogor.
3. 2 Bahan dan Alat Bahan
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah bunga rosella segar berumur 3 minggu dari daerah Darmaga. Bahan-bahan kimia yang digunakan
adalah lipase pankreas babi tipe II Sigma L3126, enzim α-glukosidase dari
Saccharomyces cerevisiae Sigma G-5003,
α-amilase dari Bacillus sp Tipe II A Sigma A-6380,
α-amilase dari pankreas babi Sigma A-3176 , p-nitrofenil laurat pNP laurat Sigma 61716, p-nitrofenil-
α-D-glukofiranosa Sigma N- 1377, pati kentang terlarut Merck, acarbosa Glucobay, bufer Tris, asam 3.5-
dinitrosalisilat DNS, sodium asetat, bufer fosfat, natrium karbonat, NaH
2
PO
4,
NaCl, CaCl
2,
NaOH, Na-K-tartarat, bromtimolblue, pereaksi folin, metanol 95, aquades.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain gelas piala, gelas ukur, labu takar, tabung reaksi, pipet volumetrik, pipet tetes, mikropipet,
bulb, neraca analitik, refraktometer, sentrifus, spektrofotometer UV-vis, penangas air,penangas air bergoyang, vortex dan hot plate.
3. 3 Metode Penelitian
Tahap awal penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan hasil ekstraksi rosella optimum berdasarkan nilai total padatan terlarut yang diperoleh.
Selanjutnya hasil ekstraksi dengan total padatan tertinggi tertinggi digunakan dalam pengujian inhibisi senyawa bioaktif tanaman terhadap kerja enzim
α-amilase, α-glukosidase dan lipase. Diagram alir penelitian seperti pada Gambar 9.
Gambar 9. Diagram alir penelitian Penentuan rasio rosella dengan larutan pengekstrak aquades
1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1;5
Pembuatan ekstrak pada berbagai kondisi pemanasan - Suhu: 70, 85, 100
o
C - Lama pemanasan ; 15 dan 30 menit
Ekstrak rosella
Pengaturan pH simulasi sistem pencernaan
Analisis: - Total polifenol
- pH - TAT
- Daya inhibisi enzim
α amilase - Daya inhibisi enzim
α glukosidase - Daya inhibisi enzim
lipase Analisis:
- Daya inhibisi enzim α amilase
- Daya inhibisi enzim α glukosidase
- Daya inhibisi enzim lipase
Pengujian kinetika inhibisi ekstrak terpilih
3.3.1 Penentuan Kadar Air dengan Metode Oven Apriyantono et al. 1989
Prinsip metode ini adalah sampel dikeringkan dalam oven 100 - 102
o
C sampai diperoleh berat yang tetap.
Cawan dikeringkan dalam oven, didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sampel dimasukkan dalam cawan dan dioven selama 6 jam pada suhu
100 - 102
o
C. Didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai berat tetap.
Perhitungan Kadar air = Kehilangan berat g x 100
wet basis Sampel sebelum kering g
3.3.2 Penentuan Rasio Pelarut
Ekstraksi pada berbagai rasio dilakukan untuk menentukan ekstrak yang memiliki nilai total padatan terlarut tertinggi untuk digunakan pada tahap
selanjutnya. Bunga rosella seberat 50 gram ditambah aquades dengan perbandingan 1:1; 1:2; 1:3; 1:4 dan 1:5 kemudian dihancurkan menggunakan
blender selama 3 - 4 menit. Hancuran sampel diekstraksi pada suhu 70
o
C selama 15 menit pada penangas air bergoyang. Hasil ekstraksi kemudian disaring
menggunakan delapan lapis kain saring sampai ekstrak tidak mengandung padatan yang terlihat. Penyaringan dilakukan secara manual, diperas menggunakan
tangan, dan dihentikan apabila busa mulai keluar. Ekstrak diukur total padatan terlarutnya menggunakan refraktometer.
3.3.3 Pembuatan Ekstrak pada Berbagai Kondisi Ekstraksi
Rosella ditambah aquades dengan perbandingan tertentu sesuai hasil tahap sebelumnya kemudian dihancurkan menggunakan blender selama 3 menit.
Hancuran sampel diekstraksi pada suhu 70
o
C, 85
o
C, 100
o
C selama 15 dan 30 menit pada penangas air bergoyang. Masing-masing sampel disaring
menggunakan kain saring, kemudian sampel ditepatkan kembali pada ke satu volume tertentu. Karakterisasi ekstrak yang dihasilkan meliputi pH, total asam
tertitrasi TAT, total fenol, daya inhibisi enzim α-amilase, α-glukosidase dan lipase.
3.3.4 Prosedur Analisis Ekstrak a Total fenol Strycharz dan Shetty. 2002
Larutan standar asam galat dibuat dengan berbagai konsentrasi yaitu 50, 100, 150, 200 dan 250 ppm. Larutan standar atau sampel sebanyak 0,5 ml
dilarutkan dalam 2,5 ml aquades, 0,5 ml etanol 95, 2,5 ml folin ciocalteau 50 kemudian divortex. Setelah itu larutan didiamkan selama 5 menit dalam ruang
gelap kemudian ditambahkan 0,5 ml Na
2
CO
3
5 dan divortex kembali. Larutan
didiamkan dalam ruang gelap selama 1 jam, berikutnya larutan diukur
absorbansinya pada λ 725 nm.
b Total asam tertitrasi Fardiaz. 1989
Sampel 10 gram dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan sampai tanda tera dengan air destilasi. Sampel yang sudah diencerkan sebanyak
10 ml dipindahkan kedalam erlenmeyer dan ditambahkan 2 tetes bromtimol blue. Titrasi dilakukan dengan menggunakan larutan NaOH 0,08 N sampai timbul
warna biru. Total asam tertitrasi = ml 0,1 NaOH x N NaOH x Faktor Pengenceran x 100
gram ekstrak
c Uji inhibisi enzim α-amilase
Uji inhibisi α-amilase dilakukan mengggunakan dua sumber enzim yang
berbeda yaitu dari Bacillus sp dan pankreas babi. Uji inhibisi terhadap enzim α-
amilase pankreas babi hanya dilakukan pada ekstrak yang mempunyai daya hambat paling tinggi karena hanya digunakan sebagai pembanding saja.
- Uji inhibisi enzim α-amilase Bacillus sp secara in vitro Cengiz et al. 2010
Persiapan reagen: Enzim dibuat dengan melarutkan 1 unitml enzim
α-amilase dari Bacillus sp tipe II A pada aquades dingin. Aktivitas inhibisi enzim
α-amilase dideteksi dengan menggunakan substrat larutan pati 1 pada bufer fosfat 20mM pH 6,9
yang berisi sodium klorida 6,7mM. Pereaksi DNS dibuat dengan mencampurkan 20 ml larutan Na-K-tartarat, 50 ml DNS dan aquades hingga diperoleh volume
akhir 100 ml. Larutan Na-K-tartarat diperoleh dengan melarutkan 30 g Na-K- tartarat dalam 20 ml NaOH 2M diatas plat pemanas jangan sampai mendidih.
Larutan DNS diperoleh dengan melarutkan 1094,88 mg asam 3,5 dinitrosalisilat dalam 50 ml air suling pada suhu 45-50
o
C. Kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini adalah acarbosa 0,5 mgml yang diperoleh dari pelarutan 1 tablet
glukobay 50 mg acarbosa dalam 100 ml HCl 2 N.
Prosedur Analisis: Campuran reaksi terdiri dari blanko, kontrol A, kontrol B, dan sampel.
Tabel 4 menunjukkan kombinasi jumlah ekstrak, bufer fosfat, dan enzim yang diberikan pada blanko, kontrol A, kontrol B, sampel serta acarbose sebagai
kontrol positif. Blanko digunakan untuk menghitung gula-gula sederhana awal pada substrat yang bukan hasil hidrolisis enzim. Kontrol A digunakan untuk
menghitung seluruh gula baik gula awal maupun gula sederhana hasil hidrolisis enzim. Kontrol B bertujuan untuk menghitung gula sederhana awal pada substrat
dan ekstrak rosella sedangkan sampel bertujuan untuk menghitung gula sederhana awal pada substrat dan ekstrak rosella serta gula hasil hidrolisis enzim dengan
dengan adanya inhibitor yaitu ekstrak rosella. Masing-masing campuran reaksi diinkubasi dalam penangas air pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Selanjutnya DNS di tambahkan dan diinkubasi selama 5 menit pada air mendidih. Setelah itu
aquades ditambahkan dan diukur absorbansinya pada spektrofotometer λ 540 nm.
Tabel 4. Komposisi larutan pada analisis aktivitas inhibisi alfa amilase
Larutan Blanko µl Kontrol A
µl Kontrol B
µl Sampel
µl Acarbose
µl Ekstrak
- -
100 100
100 Bufer
200 100
100 -
- Enzim
- 100
- 100
100 Pati
100 100
100 100
100 DNS
200 200
200 200
200 Aquades
4000 4000
4000 4000
4000
Aktivitas inhibisi sampel dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
Keterangan : A1 = Absorbansi kontrol A – Absorbansi blanko
A2 = Absorbansi sampel – Absorbansi kontrol B
- Uji inhibisi enzim α-amilase pankreas babi secara in vitro Thalapaneni-
et al. 2008
Persiapan reagen: Reagen A adalah bufer natrium fosfat 20 mM dengan penambahan natrium
klorida 6,7 mM yang ditepatkan pH nya sampai 6,9 menggunakan NaOH 1M. Larutan natrium fosfat dibuat dengan mencampurkan 2,7602 gram natrium fosfat
monobasic BM 137,99 dalam 1 liter aquades. Larutan natrium klorida dibuat dengan mencampurkan 0,3915 gram NaCl BM 58,44 dalam 1 liter aquades.
Larutan natrium fosfat ditambahkan pada larutan natrium klorida dengan perbandingan 1:1 kemudian pH ditepatkan sampai 6,9. Larutan substrat diperoleh
dengan memanaskan 1 g pati kentang terlarut dalam 100 ml reagen A sambil diaduk sampai mendidih selama 15 menit dan volume ditepatkan kembali menjadi
volume awal dengan penambahan aquades. Larutan enzim α-amilase dibuat
dengan melarutkan 0,1 mg α-amilase pankreas babi 10 unitmg dalam 1 ml
aquades dingin. Pereaksi DNS dibuat seperti pada uji inhibisi enzim α-amilase
Bacillus sp.
Prosedur Analisis: Uji inhibisi α-amilase pankreas babi sama dengan uji inhibisi terhadap
α-amilase Bacillus sp.
d Uji Inhibisi enzim α-glukosidase secara in vitro Mayur et al. 2010 dengan
modifikasi
Persiapan reagen: Uji inhibisi enzim
α-glukosidase Saccharomyces cerevisiae tipe I secara in vitro
dilakukan dengan menggunakan model penghambatan pemecahan substrat p
-nitrofenil- α-D-glukofiranosa menjadi p-nitrofenil berwarna kuning dan
glukosa oleh enzim α-glukosidase. Aktivitas inhibisi enzim diukur berdasarkan
warna hasil reaksi menggunakan spektrofotometer pada λ 410nm.
Enzim α-glukosidase berasal dari Saccharomyces cerevisiae tipe I dengan aktivitas 0,2 unitml. Aktivitas inhibisi enzim
α-glukosidase dideteksi dengan menggunakan substrat p-nitrofenil-
α-D-glukofiranosa 0,5mM. Bufer yang digunakan adalah bufer kalium fosfat 0,1 M dengan pH 7,0. Kontrol positif yang
digunakan pada penelitian ini adalah acarbosa 0,5 mgml yang diperoleh dari pelarutan 1 tablet glukobay 50 mg acarbosa dalam 100 ml HCl 2 N.
Prosedur Analisis: Campuran reaksi terdiri dari blanko, kontrol A, kontrol B, dan sampel.
Tabel 5 menunjukkan kombinasi jumlah ekstrak, bufer fosfat, dan enzim yang diberikan pada blanko, kontrol A, kontrol B, sampel serta acarbose sebagai
kontrol positif. Keterangan blanko, kontrol A, kontrol B, sampel sama dengan uji inhibisi α-amilase. Masing-masing campuran reaksi diinkubasi dalam penangas
air pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Reaksi enzim dihentikan dengan memasukkan campuran reaksi ke dalam penangas air suhu 100
o
C selama 5 menit.
Setelah itu aquades ditambahkan dan diukur absorbansinya pada spektrofotometer λ 410nm.
Tabel 5. Komposisi larutan pada analisis aktivitas inhibisi alfa glukosidase
Larutan Blanko µl Kontrol A
µl Kontrol B
µl Sampel
µl Acarbose
µl Ekstrak
- -
100 100
100 Bufer
200 100
100s -
- Enzim
- 100
- 100
100 Substrat
100 100
100 100
100 Aquades
2000 2000
2000 2000
2000
Aktivitas inhibisi sampel dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
Keterangan : A1 = Absorbansi kontrol A – Absorbansi blanko
A2 = Absorbansi sampel – Absorbansi kontrol B
e Uji Inhibisi enzim lipase secara in vitro Mc Dougall GJ et al. 2008
Persiapan reagen: Lipase pankreas babi tipe II Sigma L3126 dilarutkan dalam aquades
10mgml. Untuk penentuan aktivitas secara in vitro digunakan Tris bufer pH 8,2 100 mM dan p-nitrofenil laurat pNP laurat digunakan sebagai substratnya. Stok
substrat 0,08 beratvolume pNP laurat dilarutkan dalam 5mM sodium asetat pH 5,0 yang mengandung 1 triton X-100 kemudian dipanaskan pada air
mendidih selama 1 menit agar didapatkan larutan yang sempurna kemudian didinginkan pada suhu ruang.
Prosedur Analisis: Campuran reaksi terdiri dari blanko, kontrol A, kontrol B, dan sampel.
Tabel 6 menunjukkan kombinasi jumlah ekstrak, bufer Tris, dan enzim yang diberikan pada blanko, kontrol A, kontrol B, dan sampel. Keterangan blanko,
kontrol A, kontrol B, sampel sama dengan uji inhibisi α-amilase. Masing-masing
campuran reaksi diinkubasi pada 37
o
C selama 2 jam. Reaksi enzim dihentikan dengan memasukkan campuran reaksi ke dalam penangas air suhu 100
o
C selama 5 menit. Selanjutnya aquades ditambahkan pada campuran reaksi. Campuran
reaksi kemudian disentrifugasi pada 4000 rpm selama 15 menit dan dibaca menggunakan spektrofotometer pada
λ 410 nm.
Tabel 6. Komposisi larutan pada analisis aktivitas inhibisi lipase
Larutan Blanko µl Kontrol A
µl Kontrol B
µl Sampel
µl Ekstrak
- -
50 50
Bufer 200
50 150
- Enzim
- 150
- 150
Substrat 450
450 450
450 Aquades
4000 4000
4000 4000
Aktivitas inhibisi sampel dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
Keterangan : A1 = Absorbansi kontrol A – Absorbansi blanko
A2 = Absorbansi sampel – Absorbansi kontrol B
3.3.5 Pengaturan pH Simulasi Sistem Pencernaan
Sebagian ekstrak diatur pHnya menyerupai sistem pencernaan tubuh yaitu lambung dan usus halus. Mula-mula pH ekstrak diatur menjadi pH 2,0
menggunakan HCl, lalu didiamkan selama 30 menit, kemudian pH dinaikkan ke 6,8 menggunakan NaOH. Selanjutnya ekstrak diukur daya inhibisi α-amilase, α-
glukosidase dan lipase. Prosedur analisis uji inhibisi α-amilase, α-glukosidase dan
lipase sama dengan prosedur 3.3.3 di atas.
3.3.6 Kinetika Penghambatan Enzim
Prosedur uji kinetika inhibisi mirip dengan penentuan daya inhibisi, namun pada uji kinetika, konsentrasi substrat divariasikan 1; 1,25; 1,5; 1,75;
2,0; 2,25; 2,5. Sebelum uji ini dilakukan perlu diketahui dahulu pada konsentrasi berapa ekstrak rosella memberikan hambatan maksimumnya. Untuk
itu sederetan konsentrasi ekstrak 25; 50; 75; 100 akan diujikan. Ekstrak dengan konsentrasi terbaik kemudian dijadikan kandidat bagi pelaksanaan uji
kinetika inhibisi. Data yang diperoleh kemudian dikonversi dan diinterpretasikan ke dalam
persamaan Lineweaver-Burk dalam bentuk grafik. Konsentrasi substrat diubah menjadi 1[substrat] pada sumbu X, dan kecepatan reaksi pembentukan produk
hasil hidrólisis enzim diubah menjadi 1kecepatan pada sumbu Y. Selanjutnya dicari persamaan garis yang terbentuk dan tipe hambatannya berdasarkan
perpotongan garis antara kinetika enzim normal dan kinetika enzim setelah mendapat perlakuan ekstrak rosella.
4. HASIL DAN PEMBAHASAN