10 dilakukan Satiadarma, dkk., 2004. Akan tetapi, jika digabung dengan cara lain
seperti spektroskopi inframerah, resonansi magnet inti dan spektroskopi massa, maka dapat digunakan untuk identifikasi atau analisis kualitatif senyawa tersebut
Rohman, 2007. Metode spektrofotometri memiliki beberapa keuntungan antara lain
kepekaan yang tinggi, ketelitian yang baik, mudah dilakukan, cepat pengerjaannya dan dapat digunakan untuk menentukan senyawa campuran Munson, 1991.
Pada analisis kuantitatif dengan cara penetapan kadar, larutan standar obat yang akan dianalisis disiapkan, serapan sampel dan standar dapat ditentukan
Cairns, 2008, dimana konsentrasi zat dalam sampel dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Ct Cs
At As =
Keterangan: As = Absorbansi baku pembanding At = Absorbansi zat dalam sampel
Cs = Konsentrasi baku pembanding Ct = Konsentrasi zat dalam sampel
Penentuan kadar senyawa organik yang mempunyai struktur kromofor atau mengandung gugus kromofor, serta mengabsorpsi radiasi ultraviolet
penggunaanya cukup luas Satiadarma, dkk., 2004.
2.3. Spektrofotometri Derivatif
Spektrofotometri derivatif berkaitan dengan transformasi spektrum serapan menjadi spektrum derivatif pertama, kedua atau spektrum derivatif dengan order
yang lebih tinggi. Spektrum derivat pertama dibuat dengan memplotkan dA dλ
Universitas Sumatera Utara
11 dengan panjang gelombang, derivat kedua dibuat dengan memplotkan d
2
A dλ
2
dengan panjang gelombang dan seterusnya Ditjen POM, 1995. Konsep derivatif telah diperkenalkan pertama kali pada tahun 1950,
dimana terlihat memberikan banyak keuntungan. Aplikasi utama spektrofotometri derivatif ultraviolet – visibel adalah untuk identifikasi kualitatif dan analisis
senyawa dalam sampel. Metode spektrofotometri derivatif sangat cocok untuk analisis pita absorpsi yang overlapping atau tumpang tindih Owen, 1995.
Spektrum derivatif diperoleh dengan membuat absorban atau transmitan derivatif orde pertama atau orde lebih tinggi yang terkait dengan panjang
gelombang ΔA Δλ sebagai fungsi dari panjang gelombang. Spektrum dapat
menunjukkan kembali detail spektrum yang hilang dalam spektrum absorpsi biasa dan pada pengukuran konsentrasi analit yang bercampur dengan zat yang
mengganggu, analisis dipermudah dan dapat ditentukan lebih akurat pada beberapa bagian dari daerah spectrum. Pengukuran absorban derivatif dapat
dilakukan dengan men-scan monokromator yang terpasang pada panjang gelombang tetap, tetapi dengan perbedaan panjang gelombang yang sedikit,
sehingga berguna jika analit adalah dua komponen yang mengabsorpsi radiasi pada sisi pita absorpsi dari komponen yang mengganggu Satiadarma, dkk., 2004.
Pada spektrofotometri konvensional, spektrum serapan merupakan plot serapan A terhadap panjang gelombang
λ. Pada spektrofotometri derivatif, plot serapan terhadap panjang gelombang dimana:
A = f λ, order nol
dA d λ = f ′ λ, order pertama
Universitas Sumatera Utara
12 d
2
A d λ
2
= f ″ λ, order kedua
dan seterusnya Owen, 1995. Kurva serapan derivat pertama sampai derivat keempat dapat dilihat pada
Gambar 2.3.
Gambar 2.3. Kurva serapan derivat pertama sampai derivat keempat Talsky,
1994. Menurut Talsky 1994 sesuai dengan hukum Lambert-Beer, maka ada
hubungan linier antara konsentrasi dengan absorbansi untuk semua orde pada spektrofotometri derivatif adalah:
dA d λ =
x bc d²A d
λ² = x bc
d A d λ =
x bc
Universitas Sumatera Utara
13 Ada tiga aplikasi spektrofotometri derivatif yang sering digunakan dalam
anlisa kuantitatif antara lain metode zero crossing, metode peak to peak dan metode multivariate spectrrophotometric calibration Talsky, 1994.
Panjang gelombang zero crossing adalah panjang gelombang dimana senyawa tersebut mempunyai serapan nol dan menjadi panjang gelombang
analisis untuk zat lain dalam campurannya. Metode zero crossing memisahkan campuran dari spektrum derivatifnya pada saat panjang gelombang komponen
pertama tidak ada sinyal. Pengukuran pada zero crossing tiap komponen dalam campuran merupakan fungsi tunggal konsentrasi dari yang lainnya Nurhidayati,
2007. Panjang gelombang serapan maksimum suatu senyawa pada spektrum
normal akan menjadi λ zero crossing pada spektrum derivatif pertama, panjang
gelombang tersebut tidak mempunyai serapan atau dA dλ = 0 Munson, 1991. Bila campuran analit memiliki panjang gelombang zero-crossing lebih dari
satu, maka yang dipilih untuk dijadikan panjang gelombang analisis adalah panjang gelombang zero crossing yang serapan pasangannya dan campurannya
persis sama, karena pada panjang gelombang tersebut dapat secara selektif mengukur serapan senyawa pasangannya dan memiliki serapan yang paling besar.
Pada serapan yang paling besar, serapannya lebih stabil sehingga kesalahan analisis dapat diperkecil Nurhidayati, 2007. Kurva sederhana aplikasi zero
crossing dapat dilihat pada Gambar 2.4.
Universitas Sumatera Utara
14
Gambar 2.4. Kurva sederhana aplikasi zero crossing Talsky, 1994.
Metode spektrofotometri derivatif dapat digunakan untuk analisis kuantitatif zat dalam campuran dimana spektrumnya mungkin tersembunyi dalam
suatu bentuk spektrum besar yang saling tumpang tindih dengan mengabaikan proses pemisahan zat terlebih dahulu. Spektrum dalam bentuk ini menghasilkan
profil yang lebih rinci yang tidak terlihat pada spektrum normal Connors, 1982.
2.3.1. Komponen Spektrofotometer Derivatif
Komponen-komponen pada spektrofotometer UV-Visibel biasa sama dengan komponen pada spektrofotometer derivatif. Alat spektrofotometer harus
dilengkapi dengan peralatan sedemikian rupa untuk dapat menghasilkan spektrum derivatif Ditjen POM, 1995.
Biasanya spektrofotometer telah mempunyai software untuk mengolah data yang dapat dioperasikan malalui komputer yang telah terhubung dengan
spektrofotometer. Spektrofotometri derivatif merupakan metode manipulatif terhadap spektra pada spektrofotometri UV-Visibel Moffat, dkk., 2005.
Menurut Day dan Underwood 1998, unsur -unsur terpenting suatu spektrofotometer adalah sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
15 1.
Sumber-sumber lampu: lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen
kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel pada panjang gelombang antara 350- 900 nm.
2. Monokromotor: digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang
monokromatis. Alatnya berupa prisma untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian.
3. Kuvet sel: digunakan sebagai wadah sampel untuk menaruh cairan ke
dalam berkas cahaya spektrofotometer. Kuvet itu haruslah meneruskan energi radiasi dalam daerah spektrum yang diinginkan. Pada pengukuran
di daerah sinar tampak, kuvet dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah ultraviolet kita harus menggunakan sel kuarsa karena gelas
tidak tembus cahaya pada daerah ini. Kuvet tampak dan ultraviolet yang khas mempunyai ketebalan 1 cm, namun tersedia kuvet dengan ketebalan
yang sangat beraneka, mulai dari ketebalan kurang dari 1 mm sampai 10 cm bahkan lebih.
4. Detektor: Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap
cahaya pada berbagai panjang gelombang.
2.3.2. Kegunaan Spektrofotometri Derivatif
Teknik spektrofotometri derivatif menawarkan beberapa keuntungan dibandingkan dengan spektrofotometri konvensional seperti Spektrum derivatif
yang diukur dapat digunakan untuk meningkatkan perbedaan antara spektrum yang dianalisis, untuk menyelesaikan pita serapan analit yang tumpang tindih
Universitas Sumatera Utara
16 dalam analisis kualitatif dan yang paling penting untuk mengurangi efek
interferensi dari hamburan sinar, matriks , atau senyawa menyerap lainnya dalam analisis kuantitatif Owen, 1995.
Spektrofotometri derivatif banyak digunakan untuk zat-zat dalam suatu campuran yang spektrumnya saling mengganggu dan saling tumpang tindih atau
overlapping dimana zat-zat tersebut dapat larut dalam pelarut yang sama serta memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang yang berdekatan Watson,
2005. Spektrofotometri derivatif dapat memisahkan komponen secara kuantitatif,
dapat menjadi karakteristik untuk komponen murni dengan menambahkan informasi dari teknis lain seperti IR, NMR, MS dan digunakan untuk analisis
multikomponen Skujins and Varian, 1986. Beberapa keuntungan dari spektrofotometri derivatif antara lain yaitu
spektrum serivatif memberikan gambaran struktur yang terinci dari spektrum serapan dan gambaran ini makin jelas dari spektum derivatif pertama ke derivatif
keempat Munson, 1991. Selain itu dapat dilakukan analisis kuantitatif suatu komponen dalam
campuran dengan panjang gelombangnya saling berdekatan. Bila dibandingkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi KCKT, metode spektrofotometri
derivatif relatif lebih sederhana, alat dan biaya operasionalnya lebih murah dan waktu analisisnya lebih cepat Nurhidayati, 2007.
2.4. Validasi Metode Analisis
