6. Siapkan juga larutan-larutan lain yang diperlukan untuk proses pewarnaan dan
tuangkan dalam wadah yang sesuai 7.
Atur urutan larutan-larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses pewarnaan 8.
Zat warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan alkohol yang akan menyebabkan presipitasi pengendapan zat warna
Pelarut yang umum dipakai dalam proses pewarnaan adalah air dengan derajat keasaman yang netral pH 7. Disamping itu juga dapat digunakan cairan pelarut lainnya
seperti etilalkohol etanol dengan derajat konsentrasi yang bervariasi. Bila tidak ada keterangan dalam proses pelarutan yang menggunakan alkohol berarti konsentrasi
alkohol yang digunakan adalah alkohol absolut dengan konsentrasi 99.9.
2.2.2 Pulasan Pewarnaan Hematoksilin-Eosin
Pulasan pewarnaan yang sering digunakan secara rutin adalah pewarnaan yang dapat digunakan untuk memulas inti dan sitoplasma serta jaringan penyambungnya yaitu
pulasan hematoksilin-eosin HE. Pada pulasan HE digunakan dua macam zat warna yaitu hematoksilin yang berfungsi untuk memulas inti sel dan memberikan warna biru
basofilik serta eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin, digunakan untuk memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda
dengan nuansa yang berbeda. Hematoksilin merupakan zat warna alami yang pertama kali dipakai tahun 1863.
Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan senyawaan lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga. Senyawaan hematoksilin yang
dipakai adalah bentuk oksidasinya yaitu hematein. Proses oksidasi senyawaan hematoksilin ini dikenal sebagai Ripening dan dapat dipercepat prosesnya dengan
menambahkan senyawaan yang bertindak sebagai oksidator seperti merkuri oksida, hidrogen peroksida, potassium permanganat dan sodium iodat.
Selama proses oksidasi berlangsung kemampuan hematoksilin utuk mewarnai inti sel akan terus berlangsung dan akan berkurang bila proses oksidasi telah selesai. Untuk
memperpanjang proses ini larutan hematoksilin dapat disimpan dalam wadah tertutup dan disimpan dalam ruangan gelap. Dalam kondisi terpapar oleh cahaya sebaiknya larutan
diganti sekurangnya seminggu sekali. Jenis hematoksilin yang sering dipakai adalah
Universitas Sumatera Utara
mayer, delafied, Erlich, Bullard dan Bohmer, sedangkan counterstaining yang dipakai adalah eosin, safranin, dan phloxine.
Beberapa larutan hematoksilin yang digunakan adalah: 1.
Hematoksilin Erlich Zulham,2009. Hematoksilin Erlich adalah hematoksilin yang paling tahan lama, mudah
berdifferensiasi dan warnanya relatif tahan lama. Hematoksilin ini baru bisa digunakan setelah 1-2 bulan dibuat. Waktu inkubasinya adalah 30 menit dan counterstainingnya
adalah 0.5 -1 larutan eosin dalam air. Formulanya adalah sebagai berikut -
Hematoksilin ……………………... 6 gram -
Alkohol absolut ………………….. 300ml -
Akuades ………………………….. 300ml -
Glycerol ………………………….. 300 ml -
Glacial acetic acid ………………... 30 ml -
Potassium alum ……………………30 ml
Cara pembuatannya adalah sebagai berikut : -
Hematoksilin dilarutkan dalam alkohol -
Sambil digerus dalam mortar secara perlahan-lahan tambahkan bahan lainnya secara berurutan sambil digerus
- Akhirnya tambahkan kristal potassium alum Aluminium potassium sulfate
sambil menggoyang-goyang botol hingga terdapat endapan kristal alum di dasar botol.
- Botol berisi larutan hematoksilin Ehrlich kemudian ditutup secara longgar dengan
gumpalan kapas dan disimpan ditempat terang selama 1-2 bulan sehingga hematoksilinnya teroksidasi menjadi haematin. Proses ini dikenal sebagai
pematangan
2. Hematoksilin Delafield Zulham,2009.
Larutan zat warna ini tahan bertahun-tahun dalam penyimpanan, bisa digunakan 3 hari setlah pembuatan, counterstaining dengan menggunakan 0.5-1 larutan eosin dalam
air, waktu inkubasi 15-20 menit. Formula larutan pewarna ini adalah :
Universitas Sumatera Utara
- Hematoksilin kristal …………………... 6 gr
- Alkohol absolut …………………………. 50 ml
- Ammonium alum ………………………. 55 gr
- Aquades ………………………………….. 600ml
- Glycerol …………………………………… 150ml
Cara pembuiatan larutan hematoksilin Delafield adalah sebagai berikut : -
Larutkan kristal hematoksilin dengan alkohol absolut -
Larutkan ammonium alum dengan akuades hingga jenuh saturated -
Campurkan kedua larutan tersebut dan diamkan selama 3-5 hari -
Saring dan tambahkan glycerol -
Biarkan selama 3 hari dalam botol terpapar cahaya -
Setelah 3 hari simpan dalam botol tertutup dan lindungi dari cahaya
3. Hematoksilin Mayer
Larutan hematoksilin Mayer merupakan larutan yang dapat disimpan dalam waktu lama berbulan-bulan, counterstaining dengan 0.5-1 larutan eosin dan waktu
inkubasinya 10-15 menit. Formulanya adalah -
Hematoksilin kristal ……………………….. 1gr -
Aquades ……………………………………….. 1000ml -
Sodium iodate ……………………………….. 0.2 gr -
Ammoniumpotassium alum ……………. 50gr -
Citric acid ……………………………………… 1gr -
Chloral hydrate ……………………………… 50gr
Cara pembuatannya adalah sebagai berikut -
Larutkan ammoniumpotassium alum di dalam aquades -
Tambahkan hematoksilin dan campurkan secara baik -
Kemudian tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate
Universitas Sumatera Utara
- Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik
- Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya
4. Hematoksilin Harris
Larutan pewarna yang dapat dipakai segera setelah selesai dibuat, counterstaining dengan 0.5-1 larutan eosin dan waktu inkubasinya adalah 15-20 menit. Formulanya
adalah sebagai berikut -
Kristal hematoksilin …………………………… 5.0 gr -
Alkohol 100 ………………………………….. 50 ml -
Ammoniumpotassium alum …………………… 100 gr -
Distilled water …………………………………… 1000 ml -
Merkuri oksida …………………………………… 2.5 gr Cara pembuatannya adalah sebagai berikut
- Larutkan hematoksilin di dalam alkohol
- Larutkan ammoniumpotassium alum di dalam distilled water dan panaskan
- Hentikan pemanasan dan campur kedua larutan tersebut
- Panaskan dengan cepat sambil di aduk
- Hentikan pemanasan dan campurkan merkuri oksida kedalamnya perlahan-
lahan -
Panaskan kembali hingga larutan bewarna purple gelap -
Hentikan pemanasan dan tempatkan wadah berisi larutan tersebut di dalam wadah berisi air dingin hingga laurtan hematoksilin menjadi dingin
- Larutan siap untuk digunakan segera setelah dinginkan
- Tambahkan 2-4ml asam asetat glasial per 100ml Larutan untuk
meningkankan ketajaman warna inti -
Saring sebelum digunakan
Universitas Sumatera Utara
2.2.3 Larutan Counterstaining
Beberapa pulasan yang dipakai sebagai counterstaining larutan hematoksilin adalah eosin, safranin dan phloxine.
1. Larutan Eosin
Larutan eosin yang digunakan terdiri atas larutan stok Stock solution dan larutan kerja working solution. Adapun kedua larutan ini adalah sebagai berikut
1 Stock Alkohol-Eosin Eosin Y, water soluble ………………………. 1.0 gr
Distilled water ………………………………….. 20 ml Larutkan dan tambahkan
Alkohol 95 …………………………………….. 80 ml Working Eosin Solution
Eosin stock solution …………………………… 1 bagian Alkohol 80 …………………………………... 3 bagian
Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat glasial 0.5ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik
2. Larutan Phloxine
Laurtan phloxine terdiri atas larutan stock eosin, stock phloxine, working solution dan larutan Safran. Larutan-larutan tersebut adalah sebagai berikut
Stock Eosin Eosin Y water soluble …………………………… 1 gram
Distilled water ……………………………………… 100ml Stock Phloxine
Phloxine B …………………………………………….. 1.5 gr Distilled water ………………………………………... 100ml
Working Solution Stock Eosin …………………………………………….. 100ml
Universitas Sumatera Utara
Stock Phloxine …………………………………………. 10ml Alkohol 95 ……………………………………………. 780ml
Asam asetat glasial …………………………………….. 4ml 2 Alkohol Safran
Safran du Gatinais ……………………………………. 2 gram Alkohol 100 ………………………………………….. 100ml
2.3 Pulasanpewarnaan rutin yang banyak dipakai 2.3.1 Pewarnaan Mayer Hematoxylin-Eosin
