24
BAB III METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini berlangsung selama 8 bulan dari bulan Agustus 2010 sampai Maret 2011. Tempat penelitian dilakukan di Pusat Penelitian Bioteknologi,
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Cibinong dan Pusat Laboratorium Terpadu PLT, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah beberapa sampel tanah dari Kabupaten Tangerang Ciherang, Ciputat, Pasar Kemis, Kosambi, Parung Secab, Puspiptek,
Pamulang, dan Cileduk, galur B. thuringiensis pembanding Isolat Cibinong, 5 k, triptosa, tripton, yeast extract, Na
3
PO
4
, dan MnCl
2
, NaCl, HCl, EDTA, sukrosa, bromophenol blue, SDS, beta-merkaptoetanol, dithiothreitol, Acrylbis
sigma, ammonium persulfat APS, coomassie brilliant blue, glisin, resolving gel buffer
1,5M Tris-HCl pH 8,8, stacking gel buffer 0,5 M Tris-HCl pH 6,8, metanol, H
2
SO
4
, NH4OH, Na
2
CO
3
, CuSO
4
.5H
2
O, Na.K.tartrate, reagen folin, N,N,N’,N’,tetramethylethylenediamine
TEMED, BSA, standar protein marker catalog 161-0318 Bio-Rad, aquabides, dan aquades.
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah erlenmeyer, vortex, timbangan digital, cawan petri, labu ukur, mikroskop, tabung reaksi, pH meter,
jangka sorong, mikrosentrifuge Sorval , mikropipet, autoklaf, shaker, laminar air
25 flow
, inkubator, spektrofotometer UV-VIS Shimadzu, dan Mini-Protean Gel Elektrophoresis 3 cell BIO-RAD.
3.3. Cara Kerja
3.3.1. Isolasi bakteri dari tanah
Teknik isolasi yang dilakukan menggunakan metode Travera et al. 1987. Sampel tanah ditimbang sebanyak 1 gram. Kemudian dimasukkan ke dalam
tabung 20 mL yang telah berisi 10 mL buffer fosfat 0,05 M dengan pH 6,8, dikocok dengan kuat selama 15 menit. Setelah itu, dipanaskan pada suhu 70˚C
selama 30 menit dalam waterbath, lalu dikocok lagi dengan kuat untuk meratakan penyebaran spora selama 15 menit. Sebanyak 5 dan 10 l suspensi disebarkan
pada cawan petri yang berisi agar T-3 per-liter mengandung 3 g tripton, 2 g triptosa, 1,5 g yeast extract, 0,05 M Na
3
PO
4
, 0,005 M MnCl
2
dalam 12 g agar . Pengerjaan dilakukan secara duplo. Kemudian diinkubasi pada suhu 28˚C selama
kurang lebih 48 jam, hingga muncul koloni yang memiliki kesamaan morfologi, warna, aroma yang sama dengan B. thuringiensis pembanding.
Dari setiap sampel dipilih 24 koloni yang betul-betul mirip dengan B. thuringiensis
pembanding, lalu ditransfer ke agar T-3 yang baru di cawan petri dan diinkubasi pada suhu 28˚C sampai terjadi sporulasi selama kurang lebih
selama 72 jam. Penapisan isolat dari 24 koloni terpilih setiap sampelnya dilakukan dengan observasi mikroskop menggunakan mikroskop fase kontras atau
cahaya biasa dengan memastikan adanya bentuk protein kristal. Pada observasi mikroskop, koloni dihomogenkan dengan menggunakan aquades steril pada kaca
objek kemudian ditutup dengan kaca penutup yang sudah dilapisi dengan vaselin.
26 Koloni yang dipastikan membentuk protein kristal dipanen dan dikoleksi sebagai
isolat baru serta disimpan pada agar Luria-Bertani miring per liter mengandung 10 g tripton, 5 g yeast extract, 10 g NaCl dalam 15 g agar dan diberi nomor isolat
sesuai dengan asal sampel.
3.3.2. Isolasi protein
Nomor-nomor isolat bakteri berkristal ditumbuhkan pada agar Luria- Bertani dalam cawan petri sebanyak 2 kali reinokulasi, kemudian diinkubasi pada
suhu 28˚C selama 24 jam. Setelah itu koloni bakteri yang tumbuh diinokulasikan dalam plat agar 2xSG per-liter mengandung 16 g nutrient broth, 2 g KCl, 0,5 g
MgSO
4
.7H
2
O, 2 mL glukosa 50 , 1 mL CaNO
3
1 M, 1 mL MnCl
2
0,1 M, 1 mL FeSO
4
1 mM dalam 17 g agar , lalu diinkubasi hingga bersporulasi selama kurang lebih 48 sampai 72 jam. Koloni yang telah bersporulasi dipanen dan dimasukkan
ke dalam microtube 1,5 mL yang berisi 1 mL NaCl 0,5 M dingin direndam dalam es dan dikocok hingga menjadi suspensi homogen. Suspensi disentrifugasi pada
13000x g selama 10 menit, supernatan dibuang dan hanya disisakan pellet pada microtube
. Pellet ditambahkan lagi 1 mL NaCl dan disentrifugasi kembali. Kemudian pellet yang diperoleh diresuspensi dengan 140 l campuran 1 SDS-
0,01 β-merkaptoetanol dan direbus selama 10 menit. Suspensi kemudian disentriugasi kembali pada 10000x g selama 10 menit
dan supernatan yang terjadi diambil sebagai sampel untuk dianalisis secara elektroforesis.
27
3.3.3. Kuantitifikasi protein dengan Lowry
a. Lowry Concentrate
2x : -
Reagen Cooper 20 g Na
2
CO
3
dalam 260 mL H2O, 0,4 CuSO
4
.5H
2
O dalam 20 mL H
2
O dan 0,2 g Na.K.tartrate dalam 20 mL H
2
O. -
10 g SDS dalam 100 mL H
2
O -
4 g NaOH dalam 100 mL H
2
O Pada waktu digunakan, 3 bagian reagen cooper ditambahkan 1 bagian SDS
dan 1 bagian NaOH. b.
0,2 N Folin reagent : campur 10 mL 2 N folin dengan 90 mL H
2
O. Terhadap 400 ul sampel ditambahkan 400 l Lowry Concentrate 2x,
inkubasi pada suhu ruang, ± 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 200 l 0,2 N Folin reagent
, lalu dihomogenkan dengan vortex setiap kali penambahan. Campuran diinkubasi 30 menit pada suhu ruang, dan dibaca dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm dengan menggunakan BSA sebagai pembanding.
3.3.4. SDS-PAGE Laemli, 1970
Karakterisasi protein dilakukan dengan elektroforesis SDS-PAGE, dengan menggunakan 12 separating gel dan 4 stacking gel. Pewarnaan dengan 0,1
coomassie brilliant blue , 50 metanol dan 10 asam asetat .
a. Preparasi sampel
Supernatan dari hasil isolasi protein diambil sebanyak 30 l
dimasukkan ke dalam microtube 100 l, kemudian ditambahkan 20 l buffer sampel 0,15 M trisHCl pH 8,8, 3,75 M EDTA, 0,75 M sukrosa, 0,075
28 bromophenol blue, 2,5 SDS, 7,4 mM dithiothreitol. Campuran
dihomogenkan dan dipanaskan selama 10 menit pada suhu 100 °C. b.
Preparasi gel elektroforesis -
Resolving gel 12
Aquabides sebanyak 3,4 mL ditambahkan 30 degassed Acrylamidebis
sebanyak 4 mL, lalu dihomogenkan. Campuran tersebut ditambahkan resolving gel buffer 1,5M Tris-HCl pH 8,8 sebanyak 2,5
mL, lalu dihomogenkan dan ditambahkan SDS 10 wv sebanyak 0,1 mL. Setelah itu, ditambahkan ammonium persulfat APS 10 sebanyak
50 l, lalu homogenkan. Kemudian ditambahkan dengan TEMED
sebanyak 5 l dan dihomogenkan kembali. -
Stacking gel 4
Aquabides sebanyak 6,1 mL ditambahkan 30 degassed Acrylamidebis
sebanyak 1,3 mL, lalu dihomogenkan. Campuran tersebut ditambahkan stacking gel buffer 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 sebanyak 2,5
mL, lalu dihomogenkan dan ditambahkan SDS 10 wv sebanyak 0,1 mL. Setelah itu, ditambahkan ammonium persulfat APS 10 sebanyak
50 l, lalu homogenkan. Kemudian ditambahkan dengan TEMED
sebanyak 10 l dan dihomogenkan kembali. c.
Pembuatan kolom gel Resolving gel
dimasukkan sedikit demi sedikit dengan menggunakan mikropipet ke dalam alat elektroforesis hingga batas untuk stacking gel.
Kemudian ditambahkan aquabides, untuk meratakan resolving gel. Setelah resolving gel
membeku, dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit, lalu
29 dipasangkan sisir pembentuk sumur atau kolom, dan dibiarkan hingga
membeku lalu sisir dapat diangkat. Hasil gel tersebut kemudian dipasang pada perangkat elektroforesis.
d. Loading sampel
Larutan buffer dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Kemudian sampel sebanyak 10 l dimasukkan ke dalam kolom gel dengan hati-hati lalu
di elektroforesis selama ± 100 menit dengan tegangan elektrik 120 volt. e.
Pewarnaan dan pencucian gel Gel diangkat lalu diwarnai dengan coomassie brilliant blue stainning
gel selama semalaman. Kemudian gel diangkat dan dimasukkan ke dalam
aquades dan dipanaskan hingga pita-pita protein terlihat jelas.
30
3.4. Desain Penelitian 3.4.1. Isolasi
Kategori