Optimasi Fase Gerak Metanol-Air Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Teofilin Dan Efedrin HCL Dalam Tablet Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

(1)

OPTIMASI FASE GERAK METANOL-AIR DAN LAJU ALIR PADA PENETAPAN KADAR CAMPURAN TEOFILIN DAN EFEDRIN HCl DALAM TABLET DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI (KCKT)

SKRIPSI

OLEH : PUTRI PRATIWI

NIM: 081524013

PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(2)

OPTIMASI FASE GERAK METANOL-AIR DAN LAJU ALIR PADA PENETAPAN KADAR CAMPURAN TEOFILIN DAN EFEDRIN HCl DALAM TABLET DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI (KCKT)

SKRIPSI

Diajukan untuk Melengkapi Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

OLEH: PUTRI PRATIWI

NIM 081524013

PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

(3)

Lembar Pengesahan Skripsi

OPTIMASI FASE GERAK METANOL-AIR DAN LAJU ALIR PADA PENETAPAN KADAR CAMPURAN TEOFILIN DAN EFEDRIN HCl DALAM TABLET DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI (KCKT)

OLEH:

PUTRI PRATIWI NIM 081524013

Dipertahankan dihadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

Pada tanggal:

Disetujui oleh:

Pembimbing I, Panitia penguji,

Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt. Dra. Nurmadjuzita, M.Si., Apt. NIP 195201041980031002 NIP 194809041974122001

Pembimbing II, Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt. NIP 195201041980031002

Prof. Dr. rer. nat. Effendy Delux Putra, SU, Apt. Drs. Salbiah, M.Si., Apt. NIP 195201041980031002 NIP 194810031987012001

Dra. Syafruddin, MS, Apt.

NIP 194811111976031003

Disahkan oleh: Dekan,

Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195311281983031002

(4)

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan nikmat, rahmat, karunia dan ridhoNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Optimasi Fase Gerak Metanol-Air dan Laju Alir pada Penetapan Kadar Campuran Teofilin dan Efedrin HCl dalam Tablet dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)”. Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

KCKT merupakan metode yang paling umum digunakan untuk penetapan kadar campuran senyawa kimia. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan kondisi optimal metode KCKT dalam penetapan kadar campuran Teofilin dan Efedrin HCl dalam tablet. Kombinasi obat ini sering digunakan untuk mengobati penyakit asma bronkial. Hendaknya hasil penelitian ini menjadi metode alternatif bagi industri farmasi pada penetapan kadar campuran Teofilin dan Efedrin HCl dalam tablet secara KCKT.

Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt., dan Prof. Dr. rer. nat. Effendy Delux Putra, SU, Apt., yang telah membimbing dengan penuh kesabaran, tulus dan ikhlas selama penelitian dan penulisan skripsi ini berlangsung. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., yang telah memberikan bantuan dan fasilitas selama masa pendidikan.

Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tulus kepada kedua orang tua, Ayahanda Punarto Wijaya (Alm) dan Ibunda Elita Tanjung tercinta, serta abang dan adik atas doa, dorongan dan pengorbanan baik moril maupun materil dalam penyelesaian skripsi ini.

Medan, Januari 2011 Penulis

(5)

OPTIMASI FASE GERAK METANOL-AIR DAN LAJU ALIR PADA PENETAPAN KADAR CAMPURAN TEOFILIN DAN EFEDRIN HCl

DALAM TABLET DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

ABSTRAK

Campuran teofilin dan efedrin HCl merupakan salah satu jenis kombinasi dalam sediaan tablet. Teofilin dan efedrin HCl adalah bronkodilator yang digunakan untuk meringankan gejala gangguan saluran pernapasan seperti asma bronkial. Penetapan kadar tablet campuran teofilin dan efedrin HCl tidak terdapat dalam monografi, baik pada Farmakope Indonesia edisi IV (1995) maupun USP (United States Pharmacopeia) edisi 30 (2007) sehingga diperlukan suatu metode analisis yang memenuhi uji validitas pada penetapan kadarnya. Metode yang dipilih yaitu Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dan untuk mendapatkan hasil analisis yang baik, maka perlu dilakukan optimasi terhadap kondisi KCKT yang digunakan. Adapun optimasi yang dilakukan yaitu perbandingan fase gerak dan laju alir.

Analisis dilakukan dengan menggunakan kolom C18 (250 mm x 4,60 mm), detektor UV-Vis pada panjang gelombang 257 nm. Kondisi kromatografi yang dioptimasi yaitu perbandingan fase gerak metanol-air dengan perbandingan 60:40, 70:30, dan 80:20. Dari hasil penelitian diperoleh perbandingan fase gerak yang terbaik adalah 60:40. Kemudian dengan perbandingan fase gerak yang terpilih dilakukan optimasi laju alir dari 0,5 ml/menit, 0,75 ml/menit, dan 1 ml/menit. Dari hasil optimasi diperoleh laju alir 0,75 ml/menit memberikan hasil yang terbaik dengan waktu retensi 3,55 menit untuk efedrin HCl dan 4,27 menit untuk teofilin; resolusi 2,53; theoretical plate 1944 untuk efedrin HCl dan 4762 untuk teofilin.

Dari hasil analisis penetapan kadar sampel campuran teofilin dan efedrin HCl dalam sediaan tablet menunjukkan semua sampel memenuhi persyaratan kadar umum untuk sediaan tablet. Hasil uji validasi yang dilakukan terhadap tablet Asthma Soho (PT. Soho Industri Pharmasi), untuk teofilin diperoleh persen recovery = 101,45%, simpangan baku relatif (RSD) = 1,25% dan untuk efedrin HCl diperoleh persen recovery = 101,30%, simpangan baku relatif (RSD) = 1,49%. Dapat disimpulkan bahwa metode KCKT yang digunakan memenuhi persyaratan akurasi dan presisi. Dengan batas deteksi (LOD) teofilin 12,6109 mcg/ml dan efedrin HCl 4,2622 mcg/ml. Batas kuantitasi (LOQ) teofilin 42,0366 mcg/ml dan efedrin HCl 14,2075 mcg/ml.

(6)

OPTIMIZATION OF METHANOL-WATER AS MOBILE PHASE AND FLOW RATE OF THE DETERMINATION OF THEOPHYLLINE AND EPHEDRINE HCl MIXTURE IN TABLETS HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD ABSTRACT

The compound of theophylline and ephedrine HCl is one of combination in tablet supply. Theophylline and ephedrine HCl are bronchodilator used to minimize the symptoms of bronchial tube diseases such as bronchial asthma. Determination of content of theophylline and ephedrine HCl in tablet did not found in monography, either in the fourth edition Farmakope Indonesia (1995) or USP (United States Pharmacopeia) 30th edition (2007) that requires an analysis method that meets the test of validity in determining the content. Method of choice is High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and in order to get best analysis, it apply the optimization to the HPLC condition. The optimization is conducted by different ratio of mobile phase and flow rate.

Analysis performed by used C18 colomn (250 mm x 4.60 mm), UV-Vis detector on wavelength 257 nm. Optimization is conducted to the ratio of mobile phase of methanol-water by ratio of 60:40, 70:30, and 80:20, respectively. Based on the results of research best mobile phase ratio is 60:40. And by ratio of choosen mobile phase, the optimization of flow rate is determine from 0.5 ml/minute, 0.75 ml/minute, and 1 ml/minute, respectively. Based on the optimization is indicated that the flow rate of 0.75 ml/minute provide the best results in the retention time is 3.55 minutes for ephedrine HCl and 4.27 minutes for theophylline; resolution 2.53; theoretical plate 1944 for ephedrine HCl and 4762 for theophylline.

Based on the results of analysis determine the sample content of theophylline and ephedrine HCl compound in tablet supply indicates that all of the sample fulfilled the general requirement of tablet. The results of validation test on the tablet of Asthma Soho (PT. Soho Industri Pharmacy), the percent recovery for theophylline is 101,45%, relative standard deviation (RSD) = 1,25% and for ephedrine HCl, the percent recovery = 101,30%, relative standard deviation (RSD) = 1,49%. It concluded that the applied HPLC method fulfill the requirement of accuracy and precision. By limit of detection (LOD) for theophylline is 12,6109 mcg/ml and ephedrine HCl 4,2622 mcg/ml. Limit of quantitation (LOQ) for theophylline is 42,0366 mcg/ml and for ephedrine HCl is 14,2075 mcg/ml.

(7)

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL ... i

HALAMAN JUDUL ... ii

HALAMAN PENGESAHAN ... iii

KATA PENGANTAR ... iv

ABSTRAK ... v

ABSTRACT ... vi

DAFTAR ISI ... vii

DAFTAR TABEL ... x

DAFTAR GAMBAR ... xi

DAFTAR LAMPIRAN ... xiii

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah ... 3

1.3 Hipotesis ... 3

1.4 Tujuan Penelitian ... 3

1.5 Manfaat Penelitian ... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 5

2.1 Uraian Bahan ... 5

2.1.1 Teofilin ... 5

2.1.2 Efedrin HCl ... 6

2.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ... 7

2.3 Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ... 8

2.4 Parameter Kromatografi ... 8

2.4.1 Waktu Tambat (tR) ... 9

2.4.2 Faktor Kapasitas (k’) ... 9

2.4.3 Resolusi (Rs) ... 10

2.4.4 Selektifitas atau Faktor Pemisahan (α) ... 10

2.4.5 Faktor Tailing dan Faktor Asimetri ... 11

(8)

2.5 Komponen KCKT ... 13

2.5.1 Wadah Fase Gerak ... 13

2.5.2 Pompa ... 14

2.5.3 Injektor ... 14

2.5.4 Kolom ... 15

2.5.5 Detektor ... 16

2.5.6 Pengolah Data ... 16

2.5.7 Fase Gerak ... 16

2.6 Validasi... 17

BAB III METODOLOGI PENELITIAN... 19

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian... 19

3.2 Alat-alat ... 19

3.3 Bahan-bahan ... 19

3.4 Pengambilan Sampel ... 19

3.5 Prosedur Penelitian ... 20

3.5.1 Uji Identifikasi Baku Teofilin dan Efedrin HCl Menggunakan Spektrofotometer FTIR ... 20

3.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ... 20

3.5.3 Penyiapan Bahan ... 21

3.5.3.1 Pembuatan Fase Gerak Metanol-Air ... 21

3.5.3.2 Pembuatan Pelarut ... 21

3.5.3.3 Pembuatan Larutan Induk Baku Teofilin ... 21

3.5.3.4 Pembuatan Larutan Induk Baku Efedrin HCl ... 22

3.5.4 Prosedur Analisis. ... 22

3.5.4.1 Penyiapan Alat KCKT ... 22

3.5.4.2 Penentuan Perbandingan Fase Gerak dan Laju Alir yang Optimum ... 22

3.5.4.3 Analisis Kualitatif ... 23

3.5.4.3.1 Uji Identifikasi Teofilin dan Efedrin HCl Menggunakan KCKT ... 23

3.5.4.4 Analisis Kuantitatif ... 23 3.5.4.4.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi Teofilin BPFI . 23

(9)

3.5.4.4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Efedrin HCl

BPFI ... 24

3.5.4.4.3 Penetapan Kadar Sampel ... 24

3.5.4.5 Analisa Data Penetapan Kadar Secara Statistik ... 25

3.5.5 Metode Validasi ... 26

3.5.5.1 Akurasi... 26

3.5.5.2 Presisi ... 27

3.5.5.3 Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) .... 27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 28

4.1 Uji Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer FTIR ... 28

4.2 Penentuan Kondisi Kromatografi Untuk Mendapatkan Hasil Analisis yang Optimum... 31

4.2.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ... 31

4.2.2 Penentuan Perbandingan Fase Gerak dan Laju Alir ... 34

4.3 Uji Identifikasi Teofilin dan Efedrin HCl Menggunakan KCKT ... 35

4.4 Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi ... 39

4.5 Penetapan Kadar Sampel ... 41

4.6 Hasil Uji Validasi ... 42

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN... 44

5.1 Kesimpulan ... 44

5.2 Saran ... 44

DAFTAR PUSTAKA ... 45

(10)

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Data Absorbansi dari Kurva Serapan Teofilin ... 32

Tabel 2. Data Absorbansi dari Kurva Serapan Efedrin HCl ... 33

Tabel 3. Hasil Optimasi Fase Gerak dan Laju Alir dengan Parameter Data Waktu Retensi, Theoretical Plate dan Resolusi ... 35

Tabel 4. Data Waktu Tambat dari Kromatogram Sampel... 39

Tabel 5. Data Hasil Penyuntikan Larutan Teofilin BPFI ... 39

Tabel 6. Data Hasil Penyuntikan Larutan Efedrin HCl BPFI ... 40

Tabel 7. Hasil Penetapan Kadar Teofilin dan Efedrin HCl dalam Sediaan Tablet ... 42

Tabel 8. Data Hasil Perolehan Kembali Teofilin dan Efedrin HCl dengan Metode Penambahan Bahan Baku (Standard Addition Metdhod) ... 43

(11)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur Teofilin ... 5

Gambar 2. Struktur Efedrin Hidroklorida ... 6

Gambar 3. Kromatogram Hasil Analisis KCKT ... 9

Gambar 4. Bentuk Puncak Kromatogram ... 11

Gambar 5. Pengukuran Derajat Asimetris Puncak ... 11

Gambar 6. Diagram Skematik Alat KCKT ... 13

Gambar 7. Tipe Injektor Katup Putaran... 15

Gambar 8. Spektrum Inframerah Baku Teofilin PT. Indofarma ... 28

Gambar 9. Spektrum Inframerah Teofilin BPFI ... 29

Gambar 10. Spektrum Inframerah Baku Efedrin HCl PT. Kimia Farma ... 30

Gambar 11. Spektrum Inframerah Efedrin HCl BPFI ... 30

Gambar 12. Kurva Serapan Teofilin Baku 8 mcg/ml secara Spektrofotometri UV ... 32

Gambar 13. Kurva Serapan Efedrin HCl Baku 360 mcg/ml secara Spektrofotometri UV ... 33

Gambar 14. Kurva Serapan Teofilin Baku 8 mcg/ml dan Efedrin HCl 360 mcg/ml secara Spektrofotometri UV (Overlapping) ... 34

Gambar 15. Kromatogram Hasil Penyuntikan Larutan 500 mcg/ml Teofilin BPFI, dengan Perbandingan Metanol-Air (60:40), Laju Alir 0,75 ml/menit ... 36

Gambar 16. Kromatogram Hasil Penyuntikan Larutan 50 mcg/ml Efedrin HCl BPFI, dengan Perbandingan Metanol-Air (60:40), Laju Alir 0,75 ml/menit ... 36

Gambar 17. Kromatogram Hasil Penyuntikan Campuran Larutan Teofilin BPFI (500 mcg/ml) dan Larutan Efedrin HCl BPFI (50 mcg/ml), Fase Gerak Metanol-Air (60:40), Laju Alir 0,75 ml/menit dengan Rentang Intensitas Luas Area 0-1500 mV ... 37 Gambar 18. Kromatogram Hasil Penyuntikan Campuran Larutan

Teofilin BPFI (500 mcg/ml) dan Larutan Efedrin HCl BPFI (50 mcg/ml), Fase Gerak Metanol-Air (60:40), Laju Alir

(12)

0,75 ml/menit dengan Rentang Intensitas Luas Area 0-25

mV ... 38

Gambar 19. Kurva Kalibrasi Teofilin BPFI ... 40

Gambar 20. Kurva Kalibrasi Efedrin HCl BPFI... 41

Gambar 21. Alat KCKT (Hitachi) ... 47

Gambar 22. Vial Autosampler ... 47

Gambar 23. Sonifikator (Branson 1510) ... 48

Gambar 24. Pompa Vakum (Gast DO A-PG04-BN) dan alat penyaring fase gerak ... 48

Gambar 25. Spektrum Inframerah Teofilin (Literatur) ... 49

(13)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Gambar alat KCKT dan vial Autosampler ... 47 Lampiran 2. Gambar Sonifikator (Branson 1510) dan Penyaring ... 48 Lampiran 3. Spektrum Inframerah Teofilin pada literatur Pharmaceutical

Sub stance (UV/IR) ... 49 Lampiran 4. Spektrum Inframerah Efedrin HCl pada literatur Pharmaceutical

Sub stance (UV/IR) ... 50 Lampiran 5. Kromatogram Penyuntikan Teofilin dan Efedrin HCl Baku

untuk Mencari Perbandingan Fase Gerak Metanol-Air dan Laju Alir yang Optimal untuk Analisis ... 51 Lampiran 6. Perhitungan Persamaan Regresi dari Kurva Kalibrasi Teofilin .. 60 Lampiran 7. Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi

(LOQ) Teofilin ... 61 Lampiran 8. Perhitungan Persamaan Regresi dari Kurva Kalibrasi Efedrin

HCl ... 62 Lampiran 9. Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi

(LOQ) Efedrin HCl ... 63 Lampiran 10. Kromatogram Hasil Penyuntikan dari Larutan Tablet Asmasolon

(PT. Medifarma Laboratories, Inc)... 64 Lampiran 11. Analisis Data Statistik untuk Mencari Kadar Sebenarnya dari

Penyuntikan Larutan Tablet Asmasolon (PT. Medifarma

Laboratories, Inc) ... 70 Lampiran 12. Kromatogram Hasil Penyuntikan dari Larutan Tablet Asthma

Soho (PT. Soho Industri Pharmasi) ... 72 Lampiran 13. Analisis Data Statistik untuk Mencari Kadar Sebenarnya dari Penyuntikan Larutan Tablet Asthma Soho (PT. Soho Industri

Pharmasi) ... 78 Lampiran 14. Kromatogram Hasil Penyuntikan dari Larutan Tablet Neo

Napacin (PT. Konimex) ... 80 Lampiran 15. Analisis Data Statistik untuk Mencari Kadar Sebenarnya dari

Penyuntikan Larutan Tablet Neo Napacin (PT. Konimex) ... 86 Lampiran 16. Hasil Pengolahan Data dari Sediaan Tablet Campuran Teofilin

(14)

Lampiran 17. Kromatogram Hasil Penyuntikan dari Larutan Tablet Asthma Soho (PT. Soho Industri Pharmasi) dan Bahan Baku, pada Persen

Perolehan Kembali pada Rentang 80%, 100%, dan 120% ... 89

Lampiran 18. Contoh Perhitungan Persen Perolehan Kembali ... 98

Lampiran 19. Perhitungan Berat Sampel dari Lampiran 18 Setelah Penimbangan ... 100

Lampiran 20. Contoh Perhitungan Penimbangan Bahan Baku pada Persen Perolehan Kembali ... 102

Lampiran 21. Analisa Data Statistik Persen Perolehan Kembali pada Tablet Asthma Soho (PT. Soho Industri Pharmasi) ... . 103

Lampiran 22. Data Hasil Perolehan Kembali Teofilin dan Efedrin HCl pada Tablet Asthma Soho (PT. Soho Industri Pharmasi) ... 104

Lampiran 23. Contoh Perhitungan % Recovery dengan Metode Penambahan Bahan Baku (Standard Addition Method) dari Tablet Asthma Soho (PT. Soho Industri Pharmasi) ... . 105

Lampiran 24. Contoh Perhitungan Penimbangan Sampel ... . 106

Lampiran 25. Tabel Hasil Analisa Kadar Teofilin dan Efedrin HCl dalam Sampel ... . 107

Lampiran 26. Contoh Perhitungan untuk Mencari Kadar Teofilin dan Efedrin HCl ... . 109

Lampiran 27. Daftar Spesifikasi Sampel ... . 112

Lampiran 28. Sertifikat Pengujian Teofilin BPFI... . 113

Lampiran 29. Sertifikat Pengujian Efedrin HCl BPFI ... . 114

Lampiran 30. Sertifikat Bahan Baku Teofilin Pabrik dari PT. Indofarma ... 115

Lampiran 31. Sertifikat Bahan Baku Efedrin HCl Pabrik dari PT. Kimia Farma ... 116

(15)

OPTIMASI FASE GERAK METANOL-AIR DAN LAJU ALIR PADA PENETAPAN KADAR CAMPURAN TEOFILIN DAN EFEDRIN HCl

DALAM TABLET DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

ABSTRAK

(16)

OPTIMIZATION OF METHANOL-WATER AS MOBILE PHASE AND FLOW RATE OF THE DETERMINATION OF THEOPHYLLINE AND EPHEDRINE HCl MIXTURE IN TABLETS HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD ABSTRACT

(17)

BAB I PENDAHULUAN 1.1Latar Belakang

Asma bronkial atau lebih populer dengan sebutan asma atau sesak napas, telah dikenal luas di masyarakat. Salah satu obat yang digunakan dalam pengobatan penyakit asma bronkial adalah kombinasi antara teofilin dan efedrin HCl. Pada kombinasi obat tersebut, teofilin bekerja sebagai bronkodilator yang berfungsi sebagai relaksasi langsung otot polos bronki. Sedangkan efedrin HCl merupakan senyawa simpatomimetik dengan efek langsung dan tak langsung

terhadap α dan β-adrenoseptor. Karena sifat vasokonstriksinya, efedrin HCl digunakan untuk bronkodilator, dekongestan hidung, dan dekongestan mata (Siswandono dan Soekardjo, 1995).

Pada pembuatan obat, pemeriksaan kadar zat aktif merupakan persyaratan yang harus dipenuhi untuk menjamin kualitas sediaan obat. Sediaan obat yang berkualitas baik akan menunjang tercapainya efek terapeutik yang diharapkan. Salah satu persyaratan mutu adalah kadar yang dikandung harus memenuhi persyaratan kadar seperti yang tercantum dalam Farmakope Indonesia atau buku standar lainnya (Depkes RI, 2009).

Tablet campuran teofilin dan efedrin HCl tidak terdapat pada monografi, baik pada Farmakope Indonesia edisi IV (1995) maupun USP (United States

Pharmacopeia) edisi 30 (2007). Monografi dalam sediaan tablet dengan tiga

komponen yaitu teofilin, efedrin HCl, dan fenobarbital terdapat dalam USP edisi 30 (2007) yang penetapan kadarnya dapat ditentukan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, menggunakan kolom L1 (oktadesil silana) dengan fase gerak

(18)

larutan dapar fosfat pH 3,0 ± 0,05 - metanol (75:25), laju alir (flow rate) 3,0 ml/menit, dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 215 nm.

Penggunaan dapar fosfat sebagai fase gerak dapat menyumbat kolom, karena kelarutan dapar fosfat yang rendah dalam metanol dapat mengakibatkan terbentuknya endapan fosfat di kolom, sehingga akan menyulitkan dalam pembersihan kolom setelah analisis.

Analisis teofilin dan efedrin HCl dalam sediaan tablet secara KCKT sudah pernah dilakukan oleh peneliti sebelumnya (Rizky, 2007), menggunakan sistem kromatografi fase balik dengan kolom Zorbax C8, fase gerak metanol - air (40 : 60), laju alir 1 ml/menit, dan pada panjang gelombang 257 nm.

Berdasarkan hal tersebut diatas, maka peneliti mencoba memodifikasi perbandingan fase gerak metanol-air untuk analisis kuantitatif campuran teofilin dan efedrin HCl menggunakan kolom C18. Untuk mendapatkan hasil yang optimal, perlu dilakukan optimasi terhadap perbandingan fase gerak dan laju alirnya. Kemudian perbandingan fase gerak dan laju alir yang terpilih digunakan untuk menetapkan kadar teofilin dan efedrin HCl dalam tablet.

Metode KCKT mempunyai beberapa keuntungan dibanding metode analisis lain, diantaranya kolom dapat digunakan kembali, memiliki berbagai jenis detektor, waktu analisis umumnya relatif singkat, ketepatan dan ketelitian relatif tinggi serta dapat digunakan untuk menganalisis kebanyakan senyawa kimia (Meyer, 2004).

Untuk menguji validitas dari metode ini dilakukan pengujian antara lain uji akurasi dengan parameter % recovery ; uji presisi dengan parameter Koefisien

(19)

variasi (RSD); uji sensitifitas dengan parameter limit deteksi (LOD) dan limit kuantitasi (LOQ) (WHO, 1992).

1.2Perumusan Masalah

- Pada perbandingan dan laju alir berapakah fase gerak metanol-air dapat memisahkan campuran teofilin dan efedrin HCl yang memenuhi kriteria resolusi ≥ 1,5?

- Apakah kondisi optimal fase gerak yang diperoleh dapat digunakan untuk menentukan kadar campuran teofilin dan efedrin HCl dalam tablet dengan validasi metode yang memenuhi persyaratan?

1.3Hipotesis

- Perbandingan dan laju alir fase gerak metanol-air yang terpilih dapat memisahkan campuran teofilin dan efedrin HCl yang memenuhi kriteria resolusi ≥ 1,5.

- Kondisi optimal fase gerak yang diperoleh dapat digunakan untuk menentukan kadar campuran teofilin dan efedrin HCl dalam tablet dengan validasi metode yang memenuhi persyaratan.

1.4Tujuan Penelitian

- Melakukan optimasi fase gerak sehingga diperoleh perbandingan dan laju alir metanol-air yang optimal untuk pemisahan campuran teofilin dan efedrin HCl yang memenuhi kriteria resolusi ≥ 1,5.

- Menentukan kadar dan uji validasi campuran teofilin dan efedrin HCl dalam tablet menggunakan metode KCKT pada kondisi optimal fase gerak yang terpilih.

(20)

1.5Manfaat Penelitian

Sebagai metode alternatif bagi industri farmasi pada penetapan kadar campuran teofilin dan efedrin HCl dalam tablet.

(21)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Uraian Bahan

2.1.1 Teofilin

Rumus struktur :

N N

CH3

N CH3

Gambar 1. Struktur Teofilin

Nama Kimia : 1,3-dimethyl-3,7-dihydro-1H-purine-2,6-dione Rumus Molekul : C7H8N4O2.H2O

Berat Molekul : 180,17

Pemerian : Serbuk hablur, putih, tidak berbau, rasa pahit, stabil di udara

Kelarutan : Sukar larut dalam air, tetapi lebih mudah larut dalam air panas, mudah larut dalam larutan alkali hidroksida dan dalam amonium hidroksida, agak sukar larut dalam etanol, dalam kloroform dan dalam eter (Depkes RI, 1995). Teofilin merupakan derivat xantin yang menyebabkan relaksasi otot polos, terutama otot polos bronkus, serta merangsang otot jantung, dan meningkatkan diuresis. Senyawa teofilin digunakan sebagai bronkodilator yang diperlukan pada

(22)

serangan asma yang berlangsung lama (status asmatikus). Selain itu, teofilin juga digunakan sebagai profilaksis terhadap serangan asma (Ganiswara, 1995)

Teofilin mempunyai efek samping berupa mual dan muntah, baik pada penggunaan oral maupun parenteral. Pada overdose terjadi efek sentral (gelisah, sukar tidur, tremor dan konvulsi) serta gangguan pernafasan, juga efek kardiovaskuler, seperti tachycardia, aritmia dan hipotensi (Tjay & Rahardja, 2007).

2.1.2 Efedrin Hidroklorida

Rumus Struktur :

Gambar 2. Struktur Efedrin Hidroklorida

Nama Kimia : (1R,2S)-2-(methylamino)-1-phenylpropan-1-ol hydrochloride

Rumus Molekul : C10H15NO.HCl

Berat Molekul : 201,70

Pemerian : Serbuk atau hablur halus, putih, tidak berbau.

Kelarutan : Mudah larut dalam air, larut dalam etanol, tidak larut dalam eter (Depkes RI, 1995).

Efedrin HCl merupakan simpatomimetik yang bekerja secara langsung dan tidak langsung terhadap reseptor adrenergik. Obat ini juga meningkatkan tekanan darah melalui peningkatan curah jantung dan juga menyebabkan vasokonstriksi

CH3

.

HCl

OH H

(23)

pembuluh darah tepi. Selain itu, efedrin juga bersifat bronkodilatasi, menurunkan irama dan pergerakan usus, menurunkan aktivitas uterus serta merangsang pusat napas (Sweetman, 2005)

Efek samping dari Efedrin HCl yaitu pada orang yang peka terhadap Efedrin HCl, dalam dosis rendah sudah dapat menimbulkan gelisah, tremor, dan gangguan berkemih. Sedangkan pada efek sentral yaitu insomnia yang sering terjadi pengobatan kronik dan palpitasi (Tjay & Rahardja, 2007).

Saat ini, sangat banyak beredar produk obat yang mengandung kombinasi dua atau lebih bahan aktif. Kombinasi tersebut dimaksudkan agar obat dapat lebih efektif mencapai sasaran terapi. Salah satunya adalah kombinasi antara teofilin dan efedrin HCl, yang digunakan untuk meringankan gejala gangguan saluran pernapasan seperti asma bronkial, kejang bronkus dan alergi.

Asma bronkial atau lebih populer dengan sebutan asma atau sesak napas, telah dikenal luas di masyarakat. Penyakit asma bronkial adalah penyakit saluran pernapasan dengan ciri-ciri saluran pernapasan tersebut akan bersifat hipersensitif (kepekaan yang luar biasa) atau hiperaktif (bereaksi yang berlebihan) terhadap bermacam-macam rangsangan, yang ditandai dengan timbulnya penyempitan saluran pernapasan bagian bawah secara luas, yang dapat berubah derajat penyempitannnya menjadi normal kembali secara spontan dengan atau tanpa pengobatan (Anonim, 2008).

2.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif

(24)

dan beragam sehingga mampu menganalisis berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Ditjen POM, 1995).

Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar. Jadi, untuk zat – zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap merupakan pilhan yang logis (Rohman, 2007).

2.3 Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Berdasarkan jenis fase gerak dan fase diamnya, jenis pemisahan KCKT dibedakan atas :

a. Kromatografi Fase Normal

Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya silika gel, alumina, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan.

b. Kromatografi Fase Terbalik

Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang banyak dipakai adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan oktilsilan (C8). Sedangkan fase geraknya bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril (Mulja dan Suharman, 1995).

2.4 Parameter Kromatografi

Ada beberapa parameter kromatografi yang digunakan secara umum, yaitu :

(25)

Waktu tambat atau waktu retensi (tR) adalah selang waktu yang diperlukan

oleh linarut (solut) mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor (Mulja dan Suharman, 1995). Waktu tambat suatu zat selalu konstan pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dijadikan suatu dasar analisis kualitatif (Meyer, 2004).

Gambar 3. Kromatogram hasil analisis KCKT. (sumber : Meyer, V.R. 2004).

Gambar 3 menunjukkan, w adalah lebar puncak dan t0 disebut waktu hampa (void time/dead time) yaitu waktu tambat pelarut yang tidak tertahan atau waktu yang

dibutuhkan oleh fase gerak untuk melewati kolom (breakthrough time) (Meyer, 2004).

2.4.2 Faktor Kapasitas (k’)

Faktor kapasitas (k’) merupakan suatu ukuran seberapa jauh senyawa tersebut berpartisi (mengadsorpsi) ke dalam fase diam dari fase gerak. Lamanya waktu yang dibutuhkan suatu senyawa ditahan untuk melewati kolom bergantung pada faktor kapasitasnya (Watson, 2009). Faktor kapasitas suatu komponen dapat dinyatakan sebagai berikut :

(26)

Keterangan :

t0 = waktu yang diperlukan bagi suatu molekul-takditahan untuk melewati volume

hampa

tr = waktu yang diperlukan analit untuk melewati kolom 2.4.3 Resolusi (Rs)

Resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang saling berdekatan dibagi dengan rata-rata lebar puncak.

Nilai resolusi harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak yang baik (Rohman, 2007).

2.4.4 Selektifitas atau Faktor Pemisahan (α)

Selektifitas (α) adalah kemampuan sistem kromatografi untuk

membedakan analit yang berbeda. Selektifitas ditentukan sebagai rasio perbandingan faktor kapasitas (k’) dari analit yang berbeda:

(Kazakevich, 2007). Nilai selektifitas yang didapatkan dalam sistem KCKT harus lebih besar dari 1 (Ornaf dan Dong, 2005).

(27)

Faktor asimetri disebut juga “tailing factor (TF)” yaitu terjadinya pengekoran pada kromatogram sehingga bentuk kromatogram menjadi tidak simetris (Mulja dan Suharman, 1995). Idealnya, puncak kromatogram akan memperlihatkan bentuk Gaussian dengan derajat simetris yang sempurna (Ornaf and Dong, 2005). Namun kenyataannya, puncak yang simetris secara sempurna jarang dijumpai. Jika diperhatikan secara cermat, maka hampir setiap puncak dalam kromatografi memperlihatkan tailing. Pada Gambar 4 ditunjukkan tiga jenis bentuk puncak.

Gambar 4. Bentuk puncak kromatogram. (sumber: Kazakevich, Y. 2007).

Pengukuran derajat asimetris puncak dapat dihitung dengan 2 cara, yakni faktor

tailing dan faktor asimetris. Faktor tailing (Tf) dihitung dengan menggunakan

lebar puncak pada ketinggian 5% (W0,05), rumusnya dituliskan sebagai berikut.

f W T

2 05 , 0 =

(28)

Dengan nilai f merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 5%. Sedangkan faktor asimetri dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut.

1 , 0

1 , 0 a b T =

Nilai a dan b dalam perhitungan faktor asimetri merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 10%. Jika nilai T = 1, maka faktor tailing dan asimetri menunjukkan bentuk puncak yang simetris sempurna. Bila puncak berbentuk tailing, maka kedua faktor ini akan bernilai lebih besar dari 1 dan sebaliknya bila puncak berbentuk fronting, maka faktor tailing dan asimetri akan bernilai lebih kecil dari 1.

2.4.6 Efisiensi Kolom (N)

Efisiensi adalah ukuran tingkat penyebaran puncak dalam kolom. Efisiensi kolom ditunjukk an dari jumlah lempeng teoritikal atau theoretical plates (N), yang dapat dihitung dengan rumus:

Kolom yang efisien adalah kolom yang mampu menghasilkan pita sempit dan memisahkan analit dengan baik. Nilai lempeng akan semakin tinggi jika ukuran kolom semakin panjang, hal ini berarti proses pemisahan yang terjadi semakin baik. Hubungan antara nilai lempeng dengan panjang kolom disebut sebagai nilai HETP/High Equivalent of a Theoretical Plate (H). H dapat dihitung dengan rumus:

N L H =

(29)

2.5 Komponen KCKT

Gambar 6. Diagram skematik alat KCKT 2.5.1 Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert) terhadap fase gerak. Bahan yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung tandon harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit (Munson, 1991).

Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Oleh karena itu, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu dengan penyaring mikrometer untuk menghindari partikel-partikel kecil (Rohman, 2009).

(30)

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 0,1-10 ml/menit. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor (Putra, 2007).

2.5.3 Injektor

Ada 3 jenis macam injektor, yakni syringe injector, loop valve dan automatic

injector (autosampler). Syringe injector merupakan bentuk injektor yang paling

sederhana (Meyer, 2004).

Pada waktu sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Sampel dapat langsung diinjeksikan ke dalam kolom (on column injection) atau digunakan katup injeksi (Adnan, 1997).

Katup putaran (loop valve) ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 8, tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar daripada 10 µ l dan sekarang digunakan dengan cara otomatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi

LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan atmosfir. Bila

katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.

(31)

Gambar 7. Tipe injektor katup putaran

Automatic injector atau disebut juga autosampler memiliki prinsip yang mirip,

hanya saja sistem penyuntikannya bekerja secara otomatis (Meyer, 2004). 2.5.4 Kolom

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

a. Kolom analitik : diameter khas adalah 2 – 6 nm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pellikular, panjang yang umumnya adalah 50 – 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, umumnya 10 – 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

b. Kolom preparatif : umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 – 100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom tergantung pada mode KCKT yang digunakan. (Putra, 2007).

(32)

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh (Putra, 2007).

Beberapa detektor yang paling sering digunakan dalam KCKT adalah detektor spektrofotometri UV-Vis, photodiode-array (PDA), fluoresensi, indeks bias dan detektor elektrokimia (Rohman, 2007).

2.5.6 Pengolah Data

Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram. Alat pengumpul data seperti komputer, integrator dan rekorder dihubungkan ke detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor dan memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis (Rohman, 2007).

2.5.7 Fase Gerak

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Rohman, 2007)

Elusi Gradien dan Isokratik

(33)

1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi).

2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi). Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas (Rohman, 2009).

2.6 Validasi

Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (WHO, 1992).

Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analis harus divalidasi untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifikasi, linieritas dan rentang, kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan (Robutness).

Akurasi/kecermatan adalah kedekatan antara nilai hasil uji yang diperoleh lewat metode analitik dengan nilai sebenarnya. Akurasi dinyatakan dalam persen perolehan kembali (%recovery). Akurasi dapat ditentukan dengan dua metode, yakni

spiked-placebo recovery dan standard addition method. Pada spiked placebo recovery

atau metode simulasi, analit murni ditambahkan (spiked) ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi, lalu campuran tersebut dianalisis dan jumlah analit hasil

(34)

analisis dibandingkan dengan jumlah analit teoritis yang diharapkan. Jika plasebo tidak memungkinkan untuk disiapkan, maka sejumlah analit yang telah diketahui konsentrasinya dapat ditambahkan langsung ke dalam sediaan farmasi. Metode ini dinamakan standard addition method atau metode penambahan baku (Harmita, 2004)

Presisi merupakan ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel homogen yang sama. Biasanya diekspresikan sebagai relatif standar deviasi (RSD) dari sejumlah sampel yang berbeda secara signifikan secara statistik.

Batas deteksi (limit of detection, LOD) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi.

Batas kuantitasi (limit of quantitation, LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan (Rohman, 2007).

(35)

BAB III

METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Juli sampai September 2010.

3.2Alat-Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat instrumen KCKT lengkap (Hitachi) dengan pompa (L-2130), degasser (DGU 20 AS), injektor Autosampler L-2200, kolom Luna 5u C18 (250 mm x 4,60 mm), detektor UV-Vis L-2420, wadah fase gerak, vial khusus Autosampler, Sonifikator (Branson 1510), pompa vakum (Gast DOA - P604 – BN), neraca analitik (mettler Toledo), membran filter PTFE 0,5 µm dan 0,2 µm, cellulose nitrat membran filter 0,45 µm, Spektrofotometer FTIR (Shimadzu IR Prestige-21), DRS 8000 ( Diffuse

Reflecttance measuring), Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu Mini 1240). 3.3Bahan-Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu metanol HPLC Solvent (Baker Analyzed®), aquabidestilata (PT. Ikapharmindo Putramas), Teofilin dan Efedrin HCl BPFI (Badan POM RI), Teofilin baku pabrik (PT. Indofarma), Efedrin HCl baku pabrik (PT. Kimia Farma), tablet Asmasolon (PT. Medifarma Laboratories, Inc), tablet Asthma-Soho (PT. Soho Industri Pharmasi), tablet Neo Napacin (PT. Konimex).

3.4 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel secara purposif yaitu tanpa membandingkan antara satu tempat dengan tempat yang lain, karena tempat pengambilan sampel

(36)

dianggap homogen. Sampel yang digunakan adalah tablet Asmasolon (PT. Medifarma Laboratories, Inc), tablet Asthma-Soho (PT. Soho Industri Pharmasi), tablet Neo Napacin (PT. Konimex).

3.5 Prosedur Penelitian

3.5.1 Uji Identifikasi Baku Teofilin dan Efedrin HCl Menggunakan Spektrofotometer FTIR

Uji identifikasi baku Teofilin dan Efedrin HCl dapat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer FTIR, yaitu dengan cara : masing-masing ditimbang 10 mg, lalu dicampur dengan 100 mg serbuk KBr dalam lumpang, digerus hingga halus dan homogen, masing-masing campuran tersebut diletakkan pada sampel pan kemudian dipasangkan pada DRS 8000 dan dianalisa pada bilangan gelombang 4000-500 cm-1.

3.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Sejumlah lebih kurang 25 mg bahan baku Teofilin ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan metanol dan dikocok homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 mcg/ml, larutan induk baku I (LIB I). Dipipet sebanyak 10 ml LIB I, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan metanol dan dikocok homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 mcg/ml, larutan induk baku II (LIB II).

Sejumlah lebih kurang 50 mg bahan baku Efedrin HCl ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml, dilarutkan dengan metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan metanol dan dikocok homogen,

(37)

sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 2000 mcg/ml, larutan induk baku I (LIB I).

Kemudian dipipet sebanyak 4,0 ml LIB II Teofilin, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan metanol dan dikocok homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 8,0 mcg/ml. Dan dipipet sebanyak 4,5 ml LIB I Efedrin HCl, dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, dilarutkan dengan metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan metanol dan dikocok homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 360 mcg/ml. Masing-masing larutan diukur serapan pada panjang gelombang 200-400 nm.

3.5.3 Penyiapan Bahan

3.5.3.1 Pembuatan Fase Gerak Metanol - Air

Metanol 500 ml disaring dengan menggunakan membran filter PTFE 0,5 µ m dan diawaudarakan selama 20 menit.

Aquabidestilata 500 ml disaring dengan menggunakan cellulose nitrat membran filter 0,45 µm dan diawaudarakan selama 20 menit.

3.5.3.2 Pembuatan Pelarut

Dicampur larutan metanol dan aquabidestilata dengan perbandingan yang sama seperti perbandingan fase gerak hasil optimasi. Pelarut lalu disaring dengan penyaring membran filter PTFE 0,2 µm dan diawaudarakan selama ± 20 menit.

3.5.3.3 Pembuatan Larutan Induk Baku Teofilin

Sejumlah lebih kurang 50 mg Baku Pembanding Teofilin ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, ditambah pelarut aduk hingga

(38)

larut, lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan pelarut dan dikocok hingga homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 mcg/ml (LIB).

3.5.3.4 Pembuatan Larutan Induk Baku Efedrin HCl

Sejumlah lebih kurang 25 mg Baku Pembanding Efedrin HCl ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, ditambah pelarut aduk hingga larut, lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan pelarut dan dikocok hingga homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 mcg/ml (LIB).

3.5.4 Prosedur Analisis

3.5.4.1 Penyiapan Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan C18 (250 mm x 4,60 mm), detektor UV-Vis pada panjang gelombang analisis yang diperoleh dengan sensitifitas 1,000 AUFS. Pompa menggunakan mode aliran tetap dengan sistem elusi gradien.

Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir selama 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar, menandakan sistem tersebut telah stabil.

3.5.4.2 Penentuan Perbandingan Fase Gerak dan Laju Alir yang Optimum

Dipipet 5,0 ml Larutan Induk Baku Teofilin dan 1,0 ml Larutan Induk Baku Efedrin HCl masukkan dalam labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, kocok sehingga diperoleh larutan Teofilin dengan konsentrasi 500 mcg/ml dan Efedrin HCl dengan konsentrasi 50 mcg/ml, disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm, kemudian diinjeksikan ke dalam sistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10 µl, menggunakan fase gerak metanol - air, dengan perbandingan (60 : 40), (70 : 30), dan (80 : 20), dengan laju

(39)

alir 0,5 ml/menit, 0,75 ml/menit, dan 1,0 ml/menit, dan dideteksi pada panjang gelombang 257 nm. Kemudian dipilih perbandingan fase gerak dan laju alir yang memberikan data yang terbaik.

3.5.4.3 Analisis Kualitatif

3.5.4.3.1 Uji Identifikasi Teofilin-Efedrin HCl Menggunakan KCKT

Larutan Induk Baku Teofilin dipipet 5,0 ml masukkan dalam labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, dikocok sehingga diperoleh larutan Teofilin dengan konsentrasi 500 mcg/ml.

Larutan Induk Baku Efedrin HCl dipipet 1,0 ml masukkan dalam labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, dikocok sehingga diperoleh larutan Efedrin HCl dengan konsentrasi 50 mcg/ml.

Masing-masing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µ m dan diawaudarakan selama 5 menit, diinjeksikan ke dalam sistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10 µ l, menggunakan perbandingan fase gerak dan laju alir yang memberikan pemisahan yang terbaik, kemudian dicatat masing-masing waktu tambatnya. Kemudian waktu tambat Teofilin dan Efedrin HCl BPFI dibandingkan dengan waktu tambat masing-masing sampel. Apabila waktu tambat sampel hampir sama dengan waktu tambat BPFI, maka sampel mengandung Teofilin dan Efedrin HCl.

3.5.4.4 Analisis Kuantitatif

3.5.4.4.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi Teofilin BPFI

Larutan Induk Baku Teofilin dipipet sebanyak 3,5 ml, 4,0 ml, 4,5 ml, 5,0 ml, 5,5 ml, dan 6,0 ml, dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda. Kocok sehingga diperoleh konsentrasi 350 mcg/ml,

(40)

400 mcg/ml, 450 mcg/ml, 500 mcg/ml, 550 mcg/ml, dan 600 mcg/ml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm, dan diinjeksikan kesistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10 µ l dideteksi pada panjang gelombang 257 nm. Selanjutnya dari luas area yang diperoleh pada kromatogram dibuat kurva kalibrasi dihitung persamaan garis regresi dan faktor korelasinya.

3.5.4.4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Efedrin HCl BPFI

Larutan Induk Baku Efedrin HCl dipipet sebanyak 1,5 ml, 2,0 ml, 2,5 ml, 3,0 ml, 3,5 ml, dan 4,0 ml, dimasukkan dalam labu tentukur 25 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda. Kocok sehingga diperoleh konsentrasi 30 mcg/ml, 40 mcg/ml, 50 mcg/ml, 60 mcg/ml, 70 mcg/ml, dan 80 mcg/ml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm, dan diinjeksikan kesistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10 µ l dideteksi pada panjang gelombang 257 nm. Selanjutnya dari luas area yang diperoleh pada kromatogram dibuat kurva kalibrasi dihitung persamaan garis regresi dan faktor korelasinya.

3.5.4.4.3 Penetapan Kadar Sampel

Ditimbang 20 tablet mengandung Teofilin dan Efedrin HCl kemudian digerus, ditimbang sejumlah serbuk tablet setara dengan 130 mg Teofilin dan 12,5 mg Efedrin HCl (sebanyak 6 kali pengulangan). Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan pelarut, diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda, hingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 2600 mcg/ml Teofilin dan 250 mcg/ml Efedrin HCl, kemudian saring dengan kertas saring, 10 % filtrat pertama dibuang. Dari keenam larutan, masing-masing dipipet

(41)

2,0 ml dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 520 mcg/ml Teofilin dan 50 mcg/ml Efedrin HCl. Masing-masing larutan tersebut disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µ m dan diawaudarakan selama 5 menit, kemudian diinjeksikan sebanyak 10 µ l kesistem KCKT menggunakan vial

autosampler dan dideteksi pada panjang gelombang 257 nm dengan laju alir

terpilih kemudian hitung kadarnya.

Kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas area sampel pada Y dari persamaan regresi : Y = aX + b.

3.5.4.5 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik

Data perhitungan kadar dianalisis secara statistik menggunakan uji t. Rumus yang digunakan untuk menghitung Standar Deviasi (SD) adalah :

1 )

( 2

− − =

∑

n X X SD

Kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:

t hitung

n SD

X X

/ − =

Dengan dasar penolakan apabila t hitung ≥ t tabel, pada interval kepercayaan 99%

dengan nilai α = 0,01, dk = n-1. Keterangan :

SD = Standard deviation/simpangan baku X = Kadar dalam satu perlakuan

(42)

Untuk mencari kadar sebenarnya dapat digunakan rumus:

n SD x t

X ₍₁ ₁_/₂_α₎_dk

µ= ± −

Keterangan:

μ = Kadar sebenarnya

X = Kadar sampel n = Jumlah perlakuan

t = Harga ttabel sesuai dengan derajat kepercayaan

dk= Derajad kebebasan.

3.5.5 Metode Validasi 3.5.5.1 Akurasi

Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali dalam kaitannya dengan jumlah analit yang ditambahkan kedalam sampel, atau sebagai perbedaan antara jumlah yang diketahui dan jumlah yang ditentukan oleh analis. Uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali dilakukan dengan membuat 3 konsentrasi analit dengan rentang spesifik 80%, 100%, dan 120%, masing-masing dengan 3 replikasi dan setiap rentang spesifik mengandung 70% analit dan 30% bahan baku, kemudian dianalisa dengan perlakuan yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus:

% Perolehan kembali x100%

C B A−

Keterangan :

A = Konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan bahan baku B = Konsentrasi sampel sebelum penambahan bahan baku

(43)

3.5.5.2 Presisi

Menurut Rohman (2009), presisi merupakan ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel homogen yang sama.

Presisi seringkali dinyatakan dengan Standar Deviasi Relative (RSD) dari serangkaian data. Nilai RSD dirumuskan dengan :

% 100 x X SD RSD= Keterangan:

RSD = Standar Deviasi Relatif (%) SD = Standar deviasi

X = Kadar rata-rata sampel

3.5.5.3 Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Menurut Miller (2005), Batas Deteksi (Limit Of Detection /LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit Of Quantitation/LOQ) dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

2 ) ( 2 − − =

∑

n Yi Y SY S SY x LOD=3,3

S SY x LOQ=10

Keterangan:

SY = simpangan baku residual

(44)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Uji Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer FTIR

Baku Teofilin dan Efedrin HCl yang diperoleh dari PT. Indofarma dan PT. Kimia Farma sebelum digunakan sebagai baku pembanding terlebih dahulu diidentifikasi menggunakan Spektrofotometer FTIR pada rentang bilangan gelombang 4000 – 500 cm-1.

Spektrum Inframerah Baku Teofilin PT. Indofarma dan Teofilin BPFI dapat dilihat pada gambar bawah ini :

(45)

Gambar 2. Spektrum Inframerah Teofilin BPFI

Dari hasil pengukuran diperoleh bentuk spektrum Baku Teofilin hampir sama dengan bentuk spektrum Teofilin BPFI. Pada daerah sidik jari diperoleh data bilangan gelombang Baku Teofilin yang hampir sama dengan bilangan gelombang yang terdapat di dalam literatur dan bilangan gelombang Teofilin BPFI seperti pada tabel di bawah ini.

Nama Data Peak (cm-1)

Clarke’s 1670 1717 1567 745 980 1190

Teofilin BPFI 1641.42 1703.14 1566.2 744.52 981.77 1190.08 Teofilin Baku

PT. Indofarma 1651.07 1705.07 1568.13 742.59 979.84 1190.08

Pada daerah gugus fungsi terdapat bilangan gelombang 3344,57 cm-1,ini menunjukkan adanya gugus amin sekunder, dan pada daerah sidik jari terdapat bilangan gelombang 1705,07 cm-1 yang menunjukkan adanya gugus karbonil (C=O). Dari data spektrum yang diperoleh dapat diambil kesimpulan bahwa baku yang diidentifikasi adalah Teofilin.

(46)

Spektrum Inframerah Baku Efedrin HCl PT. Kimia Farma dan Efedrin HCl BPFI dapat dilihat pada gambar bawah ini :

Gambar 3. Spektrum Inframerah Baku Efedrin HCl PT. Kimia Farma

(47)

Dari hasil pengukuran diperoleh bentuk spektrum Baku Efedrin HCl hampir sama dengan bentuk spektrum Efedrin HCl BPFI. Pada daerah sidik jari diperoleh data bilangan gelombang Baku Efedrin HCl yang hampir sama dengan bilangan gelombang yang terdapat di dalam literatur dan bilangan gelombang Efedrin HCl BPFI seperti pada tabel di bawah ini.

Nama Data Peak (cm-1)

Clarke’s 994 699 754 1049 1242 670

Efedrin HCl BPFI 993.34 700.16 752.24 1049.28 1242.16 673.16 Efedrin HCl Baku

PT. Kimia Farma 993.34 700.16 752.24 1049.28 1242.16 673.16

Dari spektrum terlihat adanya gugus OH pada bilangan gelombang 3331,07 cm-1 dan adanya gugus amin primer padabilangan gelombang 3645,46 cm-1, 3624,25 cm-1. Ini menunjukkan bahwa baku yang diidentifikasi adalah Efedrin HCl.

4.2 Penentuan Kondisi Kromatografi untuk Mendapatkan Hasil Analisis yang Optimum

4.2.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Kadar Teofilin dan Efedrin HCl dalam sediaan tablet ditentukan dengan KCKT fase balik. Untuk mendapatkan hasil yang optimal, terlebih dahulu ditentukan kondisi kromatografi meliputi panjang gelombang analisis, komposisi fase gerak dan laju alir.

Tahap pertama dilakukan penentuan panjang gelombang maksimum dari Teofilin dan Efedrin HCl, kemudian kurva serapan yang diperoleh dibuat

overlapping.

Spektrum hasil pengukuran Teofilin dan Efedrin HCl baku dapat dilihat pada gambar 5 dan 6.

(48)

Gambar 5. Kurva Serapan Teofilin Baku 8 mcg/ml secara spektrofotometri UV

Tabel 1. Data Absorbansi dari Kurva Serapan Teofilin

Dari kurva serapan ini, dapat disimpulkan bahwa Teofilin memberikan serapan maksimal pada panjang gelombang 270 nm.

(49)

Gambar 6. Kurva Serapan Efedrin HCl Baku 360 mcg/ml secara spektrofotometri UV

Tabel 2. Data Absorbansi dari Kurva Serapan Efedrin HCl

Dari kurva serapan ini, dapat disimpulkan bahwa Efedrin HCl memberikan serapan maksimal pada panjang gelombang 257 nm.

(50)

Gambar 7. Kurva Serapan Teofilin Baku 8 mcg/ml dan Efedrin HCl Baku 360

mcg/ml secara spektrofotometri UV ( overlapping )

Dari hasil overlapping kurva serapan Teofilin dan Efedrin HCl diperoleh panjang gelombang yang memberikan serapan optimal untuk keduanya yaitu pada 257 nm.

4.2.2 Penentuan Perbandingan Fase Gerak dan Laju Alir

Menurut Munson (1991), kepolaran pelarut merupakan ukuran kekuatan pelarut atau kemampuan untuk mengelusi suatu senyawa. Zat terlarut yang kuat berinteraksi dengan fase gerak akan terelusi lebih cepat. Mekanisme pemisahan Teofilin dan Efedrin HCl menggunakan sistem kromatografi fase terbalik, yakni suatu sistem kromatografi dimana fase geraknya bersifat polar dan fase diamnya bersifat non polar. Sistem kromatografi ini dipilih berdasarkan sifat kepolaran dari kedua komponen ini. Dilihat dari strukturnya, Efedrin HCl lebih polar daripada Teofilin sehingga Efedrin HCl akan terelusi lebih dahulu dari Teofilin.

Pada awal penelitian dilakukan orientasi terhadap bahan baku Teofilin dan Efedrin HCl menggunakan perbandingan fase gerak metanol - air yaitu (60 : 40),

(51)

(70 : 30), dan (80 : 20) pada panjang gelombang 257 nm dengan laju alir 0,5 ml/menit, 0,75 ml/menit dan 1 ml/menit. Adapun parameter yang perlu diperhatikan yaitu waktu retensi, theoritical plate dan resolusi. Hasil optimasi dapat dilihat pada tabel 3 dan gambar pada lampiran 5.

Tabel 3. Hasil optimasi fase gerak dan laju alir dengan parameter data waktu retensi, theoretical plate dan resolusi

Keterangan :

- E = Efedrin HCl - T = Teofilin

Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa perbandingan fase gerak metanol-air yang terpilih yaitu 60 : 40 dengan laju alir 0,75 ml/menit pada panjang gelombang 257 nm karena resolusinya yang baik.

Setelah didapatkan perbandingan fase gerak yang terbaik selanjutnya dilakukan uji identifikasi.

4.3Uji Identifikasi Teofilin dan Efedrin HCl Menggunakan KCKT

Hasil uji identifikasi Teofilin dan Efedrin HCl BPFI pada penyuntikan terpisah masing-masing dengan konsentrasi 500 mcg/ml dan 50 mcg/ml menggunakan fase gerak metanol-air (60:40) dengan laju alir 0,75 ml/menit Perbandingan Fase

Gerak

Waktu Retensi (menit)

Asym Theoretical

Plate Resolusi Laju Alir (ml/menit)

Metanol Air E T E T E T

60 40

5,40 6,39 1,30 1,63 1997 5554 2,39 0,5 3,55 4,27 1,13 1,55 1944 4762 2,53 0,75 2,63 3,21 1,13 1,31 1526 3885 2,41 1

70 30

5,16 5,97 - 1,79 1823 5916 2,03 0,5

3,44 3,99 1,22 1,76 1662 5092 1,95 0,75 2,59 2,99 1,15 1,46 1370 3836 1,72 1

80 20

- 5,73 - 1,62 - 6681 - 0,5

- 3,83 - 1,73 - 5572 - 0,75

(52)

diperoleh kromatogram dengan waktu tambat Teofilin 4,27 menit dan Efedrin HCl 3,69 menit, kromatogram dapat dilihat pada Gambar 8 dan 9. Waktu tambat yang diperoleh dari pengujian BPFI dibandingkan dengan waktu tambat yang diperoleh dari sampel.

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha

1 Teofilin 4.27 11960808 426.33 1.32* 4567* --- ---

Gambar 8. Kromatogram hasil penyuntikan larutan 500 mcg/ml Teofilin

BPFI, dengan perbandingan metanol-air (60:40), laju alir 0,75 ml/menit

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha

1 Efedrin 3.69 29891 367.67 0.87 1592* --- ---

Gambar 9. Kromatogram hasil penyuntikan larutan 50 mcg/ml Efedrin HCl

BPFI, dengan perbandingan metanol-air (60:40), laju alir 0,75 ml/menit

(53)

Setelah dilakukan uji identifikasi masing-masing Teofilin dan Efedrin HCl BPFI, selanjutnya dilakukan uji identifikasi terhadap campuran keduanya pada kondisi yang sama.

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha

1 Efedrin 3.59 38086 358.33 1.13 2055* --- ---

2 Teofilin 4.27 11840167 426.33 1.27* 4691* 2.40 1.19

Gambar 10. Kromatogram hasil penyuntikan campuran larutan Teofilin BPFI

(500 mcg/ml) dan larutan Efedrin HCl BPFI (50 mcg/ml), fase gerak metanol-air (60:40), laju alir 0,75 ml/menit dengan rentang intensitas luas area 0-1500 mV

Pada gambar 10, kromatogram Efedrin HCl tidak terlihat jelas pada rentang intensitas luas area 0-1500 mV. Hal ini dikarenakan perbedaan konsentrasi yang cukup besar antara Teofilin dan Efedrin HCl. Dimana konsentrasi Efedrin HCl lebih kecil dari Teofilin.

(54)

No Nama RT Area k’ Asym N (USP)

Res (USP)

Alpha

1 Efedrin 3.59 38086 358.33 1.13 2055* --- ---

2 Teofilin 4.27 11840167 426.33 1.27* 4691* 2.40 1.19

Gambar 11. Kromatogram hasil penyuntikan campuran larutan Teofilin BPFI

(500 mcg/ml) dan larutan Efedrin HCl BPFI (50 mcg/ml), fase gerak metanol-air (60:40), laju alir 0,75 ml/menit dengan rentang intensitas luas area 0-25 mV

Pada gambar 11, dengan rentang intensitas luas area 0-25 mV ternyata dapat terlihat kromatogram Teofilin dan Efedrin HCl, tetapi karena Teofilin memiliki konsentrasi yang besar sehingga kromatogram terlihat terpotong. Meskipun demikian, masing-masing komponen ini memiliki luas area yang sama dan waktu retensinya sama dengan waktu retensi Teofilin dan Efedrin HCl BPFI tunggal.

Hasil penyuntikan terhadap sampel menunjukkan waktu tambat semua sampel hampir sama dengan waktu tambat Teofilin dan Efedrin HCl BPFI. Ini menunjukkan sampel mengandung Teofilin dan Efedrin HCl. Kromatogram sampel dapat dilihat pada lampiran 10, 12, 14 dan data waktu tambat dapat dilihat pada tabel 4 berikut.

(55)

Tabel 4. Data waktu tambat dari kromatogram sampel

Nama Sediaan

Waktu Tambat Sampel (menit)

Waktu Tambat BPFI (menit)

T E T E

Tablet Asmasolon 4,23 3,55

4,27 3,69

Tablet Asthma Soho 4,21 3,44

Tablet Neo Napacin 4,23 3,57

4.4Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi

Penentuan linieritas kurva kalibrasi Teofilin dan Efedrin HCl BPFI pada rentang konsentrasi masing-masing yaitu 350 - 600 mcg/ml untuk Teofilin dan 30 – 80 mcg/ml untuk Efedrin HCl, memberikan hubungan yang linier antara luas area dan konsentrasi dengan koefisien korelasi (r) = 0,9992 untuk Teofilin dan r = 0,9977 untuk Efedrin HCl. Dimana koefisien korelasi yang diperoleh ini masih dalam batas penerimaan nilai koefisien korelasi yaitu r = 0,995 (Clarke’s, 2004). Dari hasil perhitungan diperoleh persamaan regresi Y = 23069,8760 X + 349618,7333 untuk Teofilin dan Y = 861,2829 X – 11296,3905 untuk Efedrin HCl.

Data hasil penyuntikan larutan Teofilin BPFI kesistem KCKT dapat dilihat pada tabel 5.

Tabel 5. Data hasil penyuntikan larutan Teofilin BPFI

No Konsentrasi Larutan Teofilin

(mcg/ml) Luas Area

1 350 844782

2 400 959157

3 450 10593493

4 500 11957804

5 550 13129484

6 600 14126676

Dari tabel 5 diatas, dengan memplot konsentrasi versus luas area akan diperoleh kurva kalibrasi pada gambar 12 berikut.

(56)

Gambar 12. Kurva kalibrasi Teofilin BPFI

Data hasil penyuntikan larutan Efedrin HCl BPFI kesistem KCKT dapat dilihat pada tabel 6.

Tabel 6. Data hasil penyuntikan larutan Efedrin HCl BPFI

No Konsentrasi Larutan Efedrin HCl

(mcg/ml) Luas Area

1 30 15585

2 40 23490

3 50 30272

4 60 39164

5 70 49359

6 80 58575

Dari tabel 6 diatas, dengan memplot konsentrasi versus luas area akan diperoleh kurva kalibrasi pada gambar 13 berikut.

(57)

Gambar 13. Kurva kalibrasi Efedrin HCl BPFI

4.5Penetapan Kadar Sampel

Analisis kuantitatif dapat ditentukan berdasarkan luas puncak dan tinggi puncak. Pengukuran luas puncak tidak banyak dipengaruhi oleh kondisi kromatografi dibandingkan dengan tinggi puncak, kecuali laju alir. Oleh karena itu, pengukuran luas puncak merupakan pilihan yang terbaik dalam analisis kuantitatif secara KCKT (Johnson dan Stevenson, 1991). Dimana kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas puncak yang diperoleh pada Y dari persamaan regresi.

Hasil perhitungan kadar setelah dilakukan uji statistik dapat dilihat pada Tabel 7.

(58)

Tabel 7. Hasil penetapan kadar Teofilin dan Efedrin HCl dalam sediaan tablet

No Nama Sediaan Kadar Teofilin

(%)

Kadar Efedrin HCl (%)

1 Tablet Asmasolon®

(PT. Medifarma Laboratories, Inc)

92,57 ± 0,45 102,46 ± 1,59

2 Tablet Asthma Soho®

(PT. Soho Industri Pharmasi)

98,65 ± 0,91 95,16 ± 1,72

3 Tablet Neo Napacin® (PT. Konimex)

98,53 ± 0,89 103,86 ± 1,40

Semua sediaan tablet memenuhi persyaratan umum untuk sediaan tablet yaitu mengandung Teofilin dan Efedrin HCl tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.

4.6Hasil Uji Validasi

Pada penelitian ini dilakukan uji validasi metode, dengan metode penambahan bahan baku (Standard Addition Method). Tujuan validasi ini adalah untuk menunjukkan bahwa metode yang digunakan telah sesuai dengan maksud yang dikehendaki. Uji ini meliputi uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali (% recovery) dan uji presisi dengan parameter RSD (Relatif Standar Deviasi), batas deteksi (LOD) dan batas quantitasi (LOQ).

Uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali dilakukan dengan membuat 3 konsentrasi analit dengan rentang spesifik 80%, 100%, dan 120%, masing-masing dengan 3 replikasi dan setiap rentang spesifik mengandung 70% analit dan 30% bahan baku. Kromatogram hasil penyuntikan perolehan kembali dapat dilihat pada Lampiran 17. Data hasil pengujian akurasi dan presisi yang

(59)

dilakukan untuk tablet Asthma Soho dengan metode penambahan bahan baku (Standar Addition Method) dapat dilihat pada Tabel 8 di bawah ini.

Tabel 8. Data hasil pengujian akurasi dan presisi Teofilin-Efedrin HCl dengan

metode penambahan bahan baku (Standard Addition Method) pada tablet Asthma Soho

No Rentang Spesifik (%) Luas area % Recovery

T E T E

9647689 30926 99,72 99,58

2 9657459 30933 100,07 99,66

3 9651151 31150 99,84 101,76

100

12051124 36951 102,55 99,53

5 12011617 37115 101,44 100,81

6 12043159 37207 102,32 101,55

120

14527764 47278 102,09 103,02

8 14518526 47163 101,87 102,24

9 14572268 47367 103,16 103,58

Kadar rata-rata (%) Recovery 101,45 101,30

Standar Deviasi (SD) 1,27 1,51

Relatif Standar Deviasi

(RSD)

1,25 1,49

Dari data di atas diperoleh persen perolehan kembali (% recovery) untuk Teofilin sebesar 101,45% dengan Relatif Standar Deviasi (RSD) 1,25% dan untuk Efedrin HCl sebesar 101,30% dengan Relatif Standar Deviasi (RSD) 1,49%. Syarat persen perolehan kembali yang diizinkan terletak pada rentang 98-102 % (Harmita, 2004). Nilai RSD yang diizinkan adalah ≤ 2%. Maka dapat disimpulkan bahwa metode yang digunakan dalam penelitian ini mempunyai akurasi dan presisi yang memenuhi syarat (WHO, 1992). Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) yang diperoleh dari penelitian ini sebesar 12,6109 mcg/ml dan 42,0366 mcg/ml untuk Teofilin, 4,2622 mcg/ml dan 14,2075 mcg/ml untuk Efedrin HCl.

(60)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan

Penetapan kadar Teofilin dan Efedrin HCl dalam sediaan tablet dapat dilakukan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) menggunakan kolom C18 (250 mm x 4,60 mm) dan memenuhi kriteria resolusi antara Teofilin dan Efedrin HCl yaitu ≥ 1,5. Dari hasil optimasi diperoleh kondisi kromatografi dengan perbandingan fase gerak metanol – air (60 : 40), laju alir 0,75 ml/menit, panjang gelombang 257 nm.

Kadar campuran Teofilin dan Efedrin HCl yang dianalisis dari 3 sediaan tablet di pasaran dengan kondisi kromatografi yang terpilih diperoleh hasil yang memenuhi persyaratan kadar umum untuk sediaan tablet yaitu mengandung Teofilin dan Efedrin HCl tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Hasil uji validasi yang dilakukan memberikan hasil akurasi dan presisi yang baik.

5.2 Saran

Disarankan agar dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap penetapan kadar Teofilin dan Efedrin HCl secara KCKT dengan fase gerak yang berbeda.

(61)

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. (2008). Asma Bronkial.

Depkes RI. (2009). Undang-undang RI No. 36 Tentang Kesehatan. Jakarta. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Hal 40.

Ditjen POM. (1995). Farmakope Indonesia Edisi ke IV. Jakarta. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Hal 350, 783-784.

Épshtein, N.A. (2004). Validation of HPLC Techniques for Pharmaceutical

Analysis. Pharmaceutical Chemistry Journal 38(4). Page 212-228.

Harmita. (2004). Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara

Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian. Vol I(3). Hal 117-135.

Johnson, E.L. dan Stevenson, R. (1991). Dasar Kromatografi Cair. Bandung:Penerbit ITB. Hal 236.

Kazakevich, Y. and L. LoBrutto. (2007). Introduction. In: Y. Kazakevich and L. LoBrutto (eds). HPLC for Pharmaceutical Scientists. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. Page 18-19.

Meyer, V.R. (2004). Practical High-Performance Liquid Chromatography. Fourth Edition. Chichester: John Wiley and Sons Inc. Page 4.

Miller, J.N. and J.C. Miller (2005). Statistics and Chemometrics for Analytical

Chemistry. 5th Edition. Pearson Education, Ltd. Page 116.

Moffat, A.C., M.D. Osselton., B. Widdop. (2005). Clarke’s Analysis Of Drug And

Poisons. Thirth edition. London: Pharmaceutical Press. Electronic version.

Munson, J. W. (1991). Analisis Farmasi Metode Modern. Parwa B. Surabaya: Airlangga University Press. Hal 46.

Rizky, A. M. (2007). Optimasi Fase Gerak Metanol-Air untuk Analisis Kuantitatif Campuran Teofilin dan Efedrin HCl dalam Sampel Tablet dengan Metode KCKT. Skripsi Fakultas Farmasi Airlangga Surabaya. Hal 1-3.

Rohman, A. (2009). Kromatografi untuk Analisis Obat. Edisi Pertama. Yogyakarta: Graha Ilmu. Hal 225-226.

Rohman, A. dan Gandjar, I.G. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Cetakan Pertama. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Hal 381.

(62)

Ornaf, R.M. and M.W. Dong. (2005). Key Concepts of HPLC in Pharmaceutical Analysis. In: S. Ahuja and M.W. Dong (eds). Handbook of Pharmaceutical

Analysis by HPLC. San Diego: Elsevier, Inc. Pages 22-29.

Putra, E.D.L. (2007). Dasar-dasar Kromatografi Gas & Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi. Fakultas Farmasi USU-Medan. Hal. 88-91.

Siswandono, dan Soekardjo, B. (1995). Kimia Medisinal. Surabaya: Airlangga University Press. Hal 649-651.

Snyder, L.R. and J.J. Kirkland. (1979). Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2nd Edition. New York: John Wiley & Sons, Inc. Pages 52, 250.

Sweetman, G. S. C. (2005). Martindale The Extra Pharmacopoeia. 34th Edition. London: Pharmaceutical Press. Page 1120.

Tjay, T.H. dan Rahardja, K. (2007). Obat-Obat Penting Khasiat, Penggunaan,

dan Efek-Efek Sampingnya. Edisi Keenam. Jakarta: PT. Elex Media

Komputindo. Hal. 646-650.

United States Pharmacopoeia. (2007). The National Formulary. 30th Edition . The United States Pharmacopoeial Convention. Page 3324-3325.

Watson, D.G. (2007). Analisis farmasi BA: untuk mahasiswa farmasi dan praktisi

kimia farmasi. Jakarta: EGC. Hal 261-262.

WHO. (1992). The International Pharmacopoeia. Fourth Edition. Electronic Version Geneva: World Health Organization.

(63)

Lampiran 1. Gambar alat KCKT dan vial Autosampler

Gambar 14. Alat KCKT (Hitachi)

(64)

Lampiran 2. Gambar Sonifikator (Branson 1510) dan Penyaring

Gambar 16. Sonifikator (Branson 1510)

Gambar Penyaring

Gambar 17. Pompa Vakum (Gast DO A-PG04-BN) dan alat

(65)

Lampiran 3. Spektrum Inframerah Teofilin pada literatur Pharmaceutical Sub

stance (UV/IR)

(66)

Lampiran 4. Spektrum Inframerah Efedrin HCl pada literatur Pharmaceutical

Sub stance (UV/IR)

(67)

Lampiran 5. Kromatogram Penyuntikan Teofilin dan Efedrin HCl Baku untuk

Mencari Perbandingan Fase Gerak Metanol-Air dan Laju Alir yang Optimal untuk Analisis.

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA FAKULTAS FARMASI LABORATORIUM PENELITIAN

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha 1 Efedrin 5.40 50334 539.00 1.30* 1997* --- --- 2 Teofilin 6.39 18017313 637.67 1.63* 5554 2.39 1.18

(68)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA FAKULTAS FARMASI LABORATORIUM PENELITIAN

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha 1 Efedrin 3.55 33447 353.67 1.13 1944* --- --- 2 Teofilin 4.27 11860325 425.67 1.55* 4762* 2.53 1.20

(69)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA FAKULTAS FARMASI LABORATORIUM PENELITIAN

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha 1 Efedrin 2.63 26427 262.33 1.13 1526* --- --- 2 Teofilin 3.21 8921045 319.67 1.31* 3885* 2.41 1.22

(70)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA FAKULTAS FARMASI LABORATORIUM PENELITIAN

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha 1 Efedrin 5.16 61417 515.00 --- 1823* --- --- 2 Teofilin 5.97 19062014 595.67 1.79* 5916 2.03 1.16

(71)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA FAKULTAS FARMASI LABORATORIUM PENELITIAN

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha 1 Efedrin 3.44 38694 343.00 1.22* 1662* --- --- 2 Teofilin 3.99 12576263 397.67 1.76* 5092 1.95 1.16

(72)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA FAKULTAS FARMASI LABORATORIUM PENELITIAN

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha 1 Efedrin 2.59 29358 257.67 1.15 1370* --- --- 2 Teofilin 2.99 9277634 298.33 1.46* 3836* 1.72 1.16

(73)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA FAKULTAS FARMASI LABORATORIUM PENELITIAN

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha 1 Teofilin 5.73 18115547 572.33 1.62* 6681 --- ---

(74)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA FAKULTAS FARMASI LABORATORIUM PENELITIAN

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha 1 Teofilin 3.83 12020677 381.67 1.73* 5572 --- ---

(75)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA FAKULTAS FARMASI LABORATORIUM PENELITIAN

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha 1 Teofilin 2.87 9004549 285.67 1.90* 4464* --- ---

(76)

Lampiran 6. Perhitungan Persamaan Regresi dari Kurva Kalibrasi Teofilin

No X Y XY X² Y²

1 350 8447827 2956739450 122500 71365781021929 2 400 9591575 3836630000 160000 91998310980625 3 450 10593493 4767071850 202500 112222093941049 4 500 11957804 5978902000 250000 142989076502416 5 550 13129484 7221216200 302500 172383350106256 6 600 14126676 8476005600 360000 199562974808976

∑ 2850 67846859 33236565100 1397500 790521587361251 Rerata 475 11307809,8333

b aX

Y= +

( ) ( )( )

( )

X X n Y X XY n a Σ − Σ Σ Σ − Σ =

(

)

(

)

(

) (

)

2850 1397500 6 67846859 850 . 2 0 3323656510 6 − − =

=23069,8760

aX Y b= −

=11307809,8333−

(

23069,8760

)( )

475 =349618,7333

( ) ( )( )

( )

[

2 2

]

[

( )

]

Y Y n X X n Y X XY n r Σ − Σ Σ − Σ Σ Σ − Σ =

(

) (

)(

)

(

) (

)

[

]

[

(

) (

)

]

67846859 61251 7905215873 6 2850 1397500 6 67846859 2850 0 3323656510 6 − − − = r 9992 , 0 = r

Jadi Persamaannya didapat : 7333 , 349618 8760 , 23069 + = X Y

(77)

Lampiran 7. Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Teofilin

Consentrasi Luas Puncak

Yi Y – Yi ( Y - Yi )²

X (mcg/ml) Y

1 350 8447827 8424075,33 23751,67 564141827,8 2 400 9591575 9577569,13 14005,88 196164394,5 3 450 10593493 10731062,93 -137569,93 18925485640 4 500 11957804 11884556,73 73247,27 5365162562 5 550 13129484 13038050,53 91433,47 8360079436 6 600 14126676 14191544,33 -64868,33 4207900237

∑ 37618934100 2 ) ( 2 − − =

∑

n Yi Y SB 2 6 ) 0 3761893410 ( − = SB 0054 , 96978 = SB Slope SB x LOD=3

8760 , 23069 0054 , 96978 3 x LOD= 6109 , 12 = LOD mcg/ml Slope SB x LOQ=10

8760 , 23069 0054 , 96978 10 x LOQ= 0366 , 42 = LOQ mcg/ml

(78)

Lampiran 8. Perhitungan Persamaan Regresi dari Kurva Kalibrasi Efedrin HCl

No X Y XY X² Y²

1 30 15585 467550 900 242892225

2 40 23490 939600 1600 551780100

3 50 30272 1513600 2500 916393984

4 60 39164 2349840 3600 1533818896

5 70 49359 3455130 4900 2436310881

6 80 58575 4686000 6400 3431030625

∑ 330 216445 13411720 19900 9112226711

Rerata 55 36074,1667

b aX

Y= +

( ) ( )( )

( )

X X n Y X XY n a Σ − Σ Σ Σ − Σ =

(

)

(

)

(

) ( )

330 19900 6 216445 330 13411720 6 − − =

=861,2829

aX Y b= −

=36074,1667−

(

861,2829

)( )

55 =−11296,3905

( ) ( )( )

( )

[

2 2

]

[

( )

]

Y Y n X X n Y X XY n r Σ − Σ Σ − Σ Σ Σ − Σ =

(

) ( )(

)

(

) ( )

[

]

[

(

) (

)

]

216445 9112226711 6 330 19900 6 216445 330 13411720 6 − − − = r 9977 , 0 = r

Jadi Persamaannya didapat : 3905 , 11296 2829 , 861 − = X Y

(79)

Lampiran 9. Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Efedrin HCl

Consentrasi Luas Puncak

Yi Y - Yi ( Y - Yi )²

X (mcg/ml) Y

1 30 15585 14542,0965 1042,9035 1087647,7100

2 40 23490 23154,9255 335,0745 112274,9206

3 50 30272 31767,7545 -1495,7545 2237281,5240 4 60 39164 40380,5835 -1216,5835 1480075,4120

5 70 49359 48993,4125 365,5875 133654,2202

6 80 58575 57606,2415 968,7585 938493,0313

∑ 5989426,8180 2 ) ( 2 − − =

∑

n Yi Y SB 2 6 ) 8180 , 5989426 ( − = SB 6653 , 1223 = SB Slope SB x LOD=3

2829 , 861 6653 , 1223 3 x LOD= 2622 , 4 =

LOD mcg/ml

Slope SB x LOQ=10

2829 , 861 6653 , 1223 10 x LOQ= 2075 , 14 = LOQ mcg/ml

(80)

Lampiran 10. Kromatogram Hasil Penyuntikkan dari Larutan Tablet Asmasolon

(PT. Medifarma Laboratories, Inc).

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA FAKULTAS FARMASI LABORATORIUM PENELITIAN

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha 1 Efedrin 3.57 33439 355.67 --- 1372* --- --- 2 Teofilin 4.23 11451873 422.33 2.00* 3651* 2.00 1.19

(81)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA FAKULTAS FARMASI LABORATORIUM PENELITIAN

No Nama RT Area k’ Asym N

(USP)

Res (USP)

Alpha 1 Efedrin 3.55 33345 354.33 --- 1250* --- --- 2 Teofilin 4.23 11454804 421.67 1.98* 3381* 1.94 1.19

(1)

Lampiran 28. Sertifikat Pengujian Teofilin BPFI

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

Optimasi Fase Gerak Metanol-Air Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Teofilin Dan Efedrin HCL Dalam Tablet Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

NIM: 081524013

PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

.

∑

∑

( ) ( )( )

( )

( )

(

)

(

)

(

) (

)

(

)( )

( ) ( )( )

( )

( )

[

]

[

( )

( )

]

(

) (

)(

)

(

) (

)

[

]

[

(

) (

)

]

∑

( ) ( )( )

( )

( )

(

)

(

)

(

) ( )

(

)( )

( ) ( )( )

( )

( )

[

]

[

( )

( )

]

(

) ( )(

)

(

) ( )

[

]

[

(

) (

)

]

∑

Parts

Dokumen yang terkait