pembuluh darah tepi. Selain itu, efedrin juga bersifat bronkodilatasi, menurunkan irama dan pergerakan usus, menurunkan aktivitas uterus serta merangsang pusat
napas Sweetman, 2005 Efek samping dari Efedrin HCl yaitu pada orang yang peka terhadap
Efedrin HCl, dalam dosis rendah sudah dapat menimbulkan gelisah, tremor, dan gangguan berkemih. Sedangkan pada efek sentral yaitu insomnia yang sering
terjadi pengobatan kronik dan palpitasi Tjay Rahardja, 2007. Saat ini, sangat banyak beredar produk obat yang mengandung kombinasi
dua atau lebih bahan aktif. Kombinasi tersebut dimaksudkan agar obat dapat lebih efektif mencapai sasaran terapi. Salah satunya adalah kombinasi antara teofilin
dan efedrin HCl, yang digunakan untuk meringankan gejala gangguan saluran pernapasan seperti asma bronkial, kejang bronkus dan alergi.
Asma bronkial atau lebih populer dengan sebutan asma atau sesak napas, telah dikenal luas di masyarakat. Penyakit asma bronkial adalah penyakit saluran
pernapasan dengan ciri-ciri saluran pernapasan tersebut akan bersifat hipersensitif kepekaan yang luar biasa atau hiperaktif bereaksi yang berlebihan terhadap
bermacam-macam rangsangan, yang ditandai dengan timbulnya penyempitan saluran pernapasan bagian bawah secara luas, yang dapat berubah derajat
penyempitannnya menjadi normal kembali secara spontan dengan atau tanpa pengobatan Anonim, 2008.
2.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi karena didukung oleh kemajuan dalam
teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif
Universitas Sumatera Utara
dan beragam sehingga mampu menganalisis berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran Ditjen
POM, 1995. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-
industri makanan. KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar. Jadi, untuk zat – zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap merupakan pilhan yang logis
Rohman, 2007.
2.3 Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Berdasarkan jenis fase gerak dan fase diamnya, jenis pemisahan KCKT dibedakan atas :
a. Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya silika gel, alumina, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan.
b. Kromatografi Fase Terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang banyak dipakai adalah oktadesilsilan ODS atau C18 dan oktilsilan C8. Sedangkan fase
geraknya bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril Mulja dan Suharman, 1995.
2.4 Parameter Kromatografi
Ada beberapa parameter kromatografi yang digunakan secara umum, yaitu :
2.4.1 Waktu Tambat t
R
Universitas Sumatera Utara
Waktu tambat atau waktu retensi t
R
adalah selang waktu yang diperlukan oleh linarut solut mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya
ditangkap oleh detektor Mulja dan Suharman, 1995. Waktu tambat suatu zat selalu konstan pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dijadikan suatu dasar
analisis kualitatif Meyer, 2004.
Gambar 3. Kromatogram hasil analisis KCKT. sumber : Meyer, V.R. 2004.
Gambar 3 menunjukkan, w adalah lebar puncak dan t disebut waktu hampa void
timedead time yaitu waktu tambat pelarut yang tidak tertahan atau waktu yang dibutuhkan oleh fase gerak untuk melewati kolom breakthrough time Meyer,
2004.
2.4.2 Faktor Kapasitas k’
Faktor kapasitas k’ merupakan suatu ukuran seberapa jauh senyawa tersebut berpartisi mengadsorpsi ke dalam fase diam dari fase gerak. Lamanya
waktu yang dibutuhkan suatu senyawa ditahan untuk melewati kolom bergantung pada faktor kapasitasnya Watson, 2009. Faktor kapasitas suatu komponen dapat
dinyatakan sebagai berikut :
Universitas Sumatera Utara
Keterangan : t
= waktu yang diperlukan bagi suatu molekul-takditahan untuk melewati volume hampa
t
r
= waktu yang diperlukan analit untuk melewati kolom
2.4.3 Resolusi Rs
Resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang saling berdekatan dibagi dengan rata-rata lebar puncak.
Nilai resolusi harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak yang baik Rohman, 2007.
2.4.4 Selektifitas atau Faktor Pemisahan α
Selektifitas α adalah kemampuan sistem kromatografi untuk membedakan analit yang berbeda. Selektifitas ditentukan sebagai rasio
perbandingan faktor kapasitas k’ dari analit yang berbeda:
Kazakevich, 2007. Nilai selektifitas yang didapatkan dalam sistem KCKT harus lebih besar dari 1
Ornaf dan Dong, 2005.
2.4.5 Faktor Tailing dan Faktor Asimetri
Universitas Sumatera Utara
Faktor asimetri disebut juga “tailing factor TF” yaitu terjadinya pengekoran pada kromatogram sehingga bentuk kromatogram menjadi tidak
simetris Mulja dan Suharman, 1995. Idealnya, puncak kromatogram akan
memperlihatkan bentuk Gaussian dengan derajat simetris yang sempurna Ornaf and Dong, 2005. Namun kenyataannya, puncak yang simetris secara sempurna
jarang dijumpai. Jika diperhatikan secara cermat, maka hampir setiap puncak dalam kromatografi memperlihatkan tailing. Pada Gambar 4 ditunjukkan tiga
jenis bentuk puncak.
Gambar 4. Bentuk puncak kromatogram. sumber: Kazakevich, Y. 2007.
Pengukuran derajat asimetris puncak dapat dihitung dengan 2 cara, yakni faktor tailing dan faktor asimetris. Faktor tailing T
f
dihitung dengan menggunakan lebar puncak pada ketinggian 5 W0,05, rumusnya dituliskan sebagai berikut.
f W
T 2
05 ,
=
Gambar 5. Pengukuran derajat asimetris puncak sumber : Meyer, V.R. 2004.
Universitas Sumatera Utara
Dengan nilai f merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 5. Sedangkan faktor asimetri dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut.
1 ,
1 ,
a b
T =
Nilai a dan b dalam perhitungan faktor asimetri merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 10. Jika nilai T = 1, maka faktor tailing dan asimetri
menunjukkan bentuk puncak yang simetris sempurna. Bila puncak berbentuk tailing, maka kedua faktor ini akan bernilai lebih besar dari 1 dan sebaliknya bila
puncak berbentuk fronting, maka faktor tailing dan asimetri akan bernilai lebih kecil dari 1.
2.4.6 Efisiensi Kolom N
Efisiensi adalah ukuran tingkat penyebaran puncak dalam kolom. Efisiensi kolom ditunjukk an dari jumlah lempeng teoritikal atau theoretical plates N,
yang dapat dihitung dengan rumus:
Kolom yang efisien adalah kolom yang mampu menghasilkan pita sempit dan memisahkan analit dengan baik. Nilai lempeng akan semakin tinggi jika ukuran
kolom semakin panjang, hal ini berarti proses pemisahan yang terjadi semakin baik. Hubungan antara nilai lempeng dengan panjang kolom disebut sebagai nilai
HETPHigh Equivalent of a Theoretical Plate H. H dapat dihitung dengan rumus:
N L
H =
Snyder and Kirkland, 1979.
Universitas Sumatera Utara
2.5 Komponen KCKT
Gambar 6. Diagram skematik alat KCKT 2.5.1 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung
tandon harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 mlmenit Munson, 1991.
Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing penghilangan gas yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan
komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Oleh karena itu, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih
dahulu dengan penyaring mikrometer untuk menghindari partikel-partikel kecil Rohman, 2009.
2.5.2 Pompa
Universitas Sumatera Utara
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 0,1-10 mlmenit. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut
untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor Putra, 2007.
2.5.3 Injektor
Ada 3 jenis macam injektor, yakni syringe injector, loop valve dan automatic injector autosampler. Syringe injector merupakan bentuk injektor yang paling
sederhana Meyer, 2004.
Pada waktu sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom.
Sampel dapat langsung diinjeksikan ke dalam kolom on column injection atau digunakan katup injeksi Adnan, 1997.
Katup putaran loop valve ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 8, tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
daripada 10 µ l dan sekarang digunakan dengan cara otomatis dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual. Pada posisi
LOAD, sampel loop cuplikan dalam putaran diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam
kolom.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 7. Tipe injektor katup putaran
Automatic injector atau disebut juga autosampler memiliki prinsip yang mirip, hanya saja sistem penyuntikannya bekerja secara otomatis Meyer, 2004.
2.5.4 Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom
dapat dibagi menjadi dua kelompok : a.
Kolom analitik : diameter khas adalah 2 – 6 nm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pellikular, panjang yang
umumnya adalah 50 – 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, umumnya 10 – 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
b. Kolom preparatif : umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar
dan panjang kolom 25 – 100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom
tergantung pada mode KCKT yang digunakan. Putra, 2007.
2.5.5 Detektor
Universitas Sumatera Utara
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan noise yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapanrespon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan
yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh Putra, 2007.
Beberapa detektor yang paling sering digunakan dalam KCKT adalah detektor spektrofotometri UV-Vis, photodiode-array PDA, fluoresensi, indeks
bias dan detektor elektrokimia Rohman, 2007.
2.5.6 Pengolah Data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak- puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram. Alat pengumpul
data seperti komputer, integrator dan rekorder dihubungkan ke detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor dan
memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis Rohman, 2007.
2.5.7 Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel Rohman, 2007
Elusi Gradien dan Isokratik
Elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:
Universitas Sumatera Utara
1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam
atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap komposisi fase gerak tetap selama elusi.
2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase
gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi. Elusi bergradien digunakan untuk
meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas Rohman, 2009.
2.6 Validasi
Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi
persyaratan untuk penggunaannya WHO, 1992.
Validasi metode menurut United States Pharmacopeia USP dilakukan
untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analis harus divalidasi
untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada
validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifikasi, linieritas dan rentang, kekasaran Ruggedness dan ketahanan Robutness.
Akurasikecermatan adalah kedekatan antara nilai hasil uji yang diperoleh lewat metode analitik dengan nilai sebenarnya. Akurasi dinyatakan dalam persen
perolehan kembali recovery. Akurasi dapat ditentukan dengan dua metode, yakni spiked-placebo recovery dan standard addition method. Pada spiked placebo recovery
atau metode simulasi, analit murni ditambahkan spiked ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi, lalu campuran tersebut dianalisis dan jumlah analit hasil
Universitas Sumatera Utara
analisis dibandingkan dengan jumlah analit teoritis yang diharapkan. Jika plasebo tidak memungkinkan untuk disiapkan, maka sejumlah analit yang telah diketahui
konsentrasinya dapat ditambahkan langsung ke dalam sediaan farmasi. Metode ini dinamakan standard addition method atau metode penambahan baku Harmita, 2004
Presisi merupakan ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel homogen yang sama.
Biasanya diekspresikan sebagai relatif standar deviasi RSD dari sejumlah sampel yang berbeda secara signifikan secara statistik.
Batas deteksi limit of detection, LOD didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu
dapat dikuantifikasi. Batas kuantitasi limit of quantitation, LOQ didefinisikan sebagai
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan
Rohman, 2007.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara pada bulan Juli sampai September 2010. 3.2 Alat-Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat instrumen KCKT lengkap Hitachi dengan pompa L-2130, degasser DGU 20
AS, injektor Autosampler L-2200, kolom Luna 5u C18 250 mm x 4,60 mm, detektor UV-Vis L-2420, wadah fase gerak, vial khusus Autosampler, Sonifikator
Branson 1510, pompa vakum Gast DOA - P604 – BN, neraca analitik mettler Toledo, membran filter PTFE 0,5 µm dan 0,2 µm, cellulose nitrat membran filter
0,45 µm, Spektrofotometer FTIR Shimadzu IR Prestige-21, DRS 8000 Diffuse Reflecttance measuring, Spektrofotometer UV-Vis Shimadzu Mini 1240.
3.3 Bahan-Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu metanol HPLC Solvent Baker Analyzed
®
, aquabidestilata PT. Ikapharmindo Putramas, Teofilin dan Efedrin HCl BPFI Badan POM RI, Teofilin baku pabrik PT.
Indofarma, Efedrin HCl baku pabrik PT. Kimia Farma, tablet Asmasolon PT. Medifarma Laboratories, Inc, tablet Asthma-Soho PT. Soho Industri Pharmasi,
tablet Neo Napacin PT. Konimex.
3.4 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel secara purposif yaitu tanpa membandingkan antara satu tempat dengan tempat yang lain, karena tempat pengambilan sampel
Universitas Sumatera Utara