III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Sampel diambil dari tiga ekor ikan mas jantan yang berasal dari empang di sekitar Kampus, dan tiga ekor ikan patin jantan yang berasal dari kolam
penelitian jurusan Budidaya Perairan BDP dengan kondisi sudah matang gonad, tanpa perlakuan, dan siap untuk memijah. Penelitian pendahuluan dan penelitian
utama dilakukan kurang lebih 1 tahun September 2009 sampai september 2010. Pengamatan motilitas spermatozoa dan evaluasi langsung dilakukan di
lapang dan penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Reproduksi Unit Rehabilitasi Reproduksi URR Fakultas Kedokteran Hewan, Laboratorium Biologi
Makro Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, serta Laboratorium Reproduksi Bidang
Zoologi Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Cibinong.
3.2. Alat dan Bahan Alat
Bahan Bunsen
sampel semen segar mikropipet 0,5-1,0 µl
larutan pewarna Williams tabung epphendorf 2 ml
larutan formol saline kamar hitung Neubauer
tissue Outer slide box
alkohol absolut Counter
larutan chloramin 0,5 pH indikator paper
larutan sodium sitrat 0,3
Stopwatch distilled water
mikroskop cahaya alkohol 96
mikroskop compound Nikon Optihot 2 kertas label
perangkat lunak CorelDraw X4 gelas objek
wadah penampung sperma Syringe 5 ml
Sentrifuse
3.3. Penelitian Pendahuluan
Sebelum penelitian ini dilakukan, terlebih dahulu dilakukan penelitian pendahuluan. Hal tersebut dilakukan karena belum ada metode yang ditemukan
untuk menentukan pewarnaan yang tepat pada spermatozoa ikan yang diteliti. Pada mulanya, dilakukan
pewarnaan spermatozoa dengan pewarnaan Williams sesuai dengan standar pada pewarnaan spermatozoa hewan mamalia. Karena
spermatozoa tidak terlihat, maka dilakukan percobaan dengan pewarnaan eosin dan juga nigrosin. Namun sampel spermatozoa juga tidak terlihat. Berdasarkan
penelitian yang dilakukan oleh Tuset et al., 2008 pada ikan trout Onchorynchus mykiss, perlu dilakukan pengenceran dengan sodium sitrat dan sentrifugasi,
sehingga spermatozoa menjadi cukup jelas terlihat setelah kedua metode tersebut dikolaborasikan. Langkah-langkah pewarnaan spermatozoa ikan dengan
pewarnaan Williams yang dimodifikasi berdasarkan penelitian pendahuluan, antara lain :
1. Spermatozoa segar yang diambil dari ikan diencerkan dengan larutan sodium sitrat 3 dengan perbandingan 1:100 dan dimasukkan ke
dalam tabung epphendorf 2 ml. 2. Sampel spermatozoa disentrifuse dengan kecepatan 300 g atau 1750
rpm selama 1 menit, lalu dibuat preparat ulas. 3. Preparat ulas difiksasi dari semen segar yang dikoleksi dari lapang
dengan bunsen. 4. Cuci dalam alkohol absolut selama 4 menit. Biarkan sampai kering.
5. Masukkan kedalam larutan 0.5 chloramin selama 1-2 menit, sambil diangkat dan dimasukkan kembali berkali-kali dengan tujuan
menghilangkan mukus dan ulasan terlihat jernih. 6. Cuci dalam distilled water selanjutnya masukkan ke dalam alkohol 95.
7. Warnai dengan larutan Williams selama 10 menit. Keringkan.
Tidak Tidak
Gambar 3. Skema pembuatan preparat pewarnaan williams yang dimodifikasi. Pengenceran dengan larutan NaCO
3
3 Perbandingan 1 : 100
Masukkan ke dalam epphendorf 2 ml
Fiksasi dengan bunsen
Cuci dalam Alkohol Absolut selama 4 Masukkan kedalam larutan chloramin
0,5 Selama 1-2 menit
Cuci dalam distilled water Sentrifuse 1750 rpm selama 1 menit
dibuat preparat ulas
Spermatozoa segar
Mukus hilang?
Preparat pengamatan
Warnai rendam dengan larutan Williams
Selama 10 menit, kering-udarakan Masukkan ke dalam alkohol
3.4. Metode Pengumpulan Data