32
evaporator setelah itu diuapkan hingga diperoleh ekstrak kental dan ditimbang. Kemudian ampasnya dikeringkan lalu diperkolasi kembali dengan
menggunakan pelarut berturut-turut etilasetat dan etanol 70, prosedur dilakukan sama seperti yang diatas.
3.9. Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan didalam oven pada
suhu 170°C selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset dengan lampu bunsen Lay,1994.
3.10 Pembuatan Media 3.10.1Pembuatan
Nutrient Agar
Komposisi: Beef extract
3,0 g
Peptone 5,0 g
Agar 15,0 g
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 23 g serbuk nutrient agar kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit
demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali diaduk sampai bahan larut sempurna dan jernih. Tutup erlenmeyer dengan
kapas yang dilapisi dengan aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit Difco Laboratories, 1977.
3.10.2 Pembuata Muller Hinton Agar MHA
Komposisi: Beef infusion from 300
g Casein hydrolysate
17,5 g
Universitas Sumatera Utara
33
Starch 1,50 g
Bacto – Agar 17,0
g pH = 7,4
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 36 g serbuk MHA kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit
demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali diaduk sampai bahan larut sempurna dan jernih. Tutup erlenmeyer dengan
kapas yang dilapisi dengan aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit Difco laboratories, 1977.
3.10.3 Pembuatan Nutrient Broth NB
Komposisi: Beef extract 3
g Bacto Pepton 5 g
Ditimbang sebanyak 8 gram serbuk nutrient broth kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit
demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan sebentar sambil sekali-sekali diaduk sampai terbentuk larutan jernih. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi
aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit Difco Laboratories, 1977.
3.11 Pembuatan Suspensi Standar Mc. Farland
Suspensi Standar Mc. Farland adalah suspensi yang menunjukkan konsentrasi kekeruhan bakteri sama dengan 10
8
CFUml. Komposisi:
Larutan Asam sulfat 1 9,5 ml
Larutan Barium klorida 0,5 ml
Universitas Sumatera Utara
34
Cara pembuatan: dicampur kedua larutan tersebut dalam tabung reaksi dikocok dan dihomogenkan. Apabila kekeruhan suspensi bakteri uji adalah
sama dengan kekeruhan suspensi standar, berarti konsentrasi suspensi bakteri adalah 10
6
CFUml Power, 1988.
3.12 Pembiakan Bakteri 3.12.1 Pembuatan Stok Kultur Bakteri
Biakan bakteri
Staphylococcus aureus dari strain utama diambil dengan jarum ose steril dengan metode sinambung pada permukaan nutrien agar
miring, ditutup mulut tabung reaksi dengan kapas. Diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37
o
C. Dilakukan prosedur yang sama terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli dan Salmonella typhi
Depkes, 1995.
3.12.2 Pembuatan Inokulum Bakteri
Bakteri Staphylococcus aureus hasil inkubasi diambil dengan jarum ose steril lalu disuspensikan kedalam tabung yang berisi 10 ml larutan nutrien
broth steril, kemudian dihomogenkan hingga diperoleh kekeruhan suspensi bakteri yang sama dengan kekeruhan suspensi standar Mc. Farland, ini berarti
konsentrasi suspensi bakteri adalah 10
8
CFU Colony Forming Unitml. Setelah itu dilakukan pengenceran dengan memipet 0,1 ml biakan bakteri
10
8
CFUml, dimasukkan kedalam tabung steril yang berisi larutan nutrien broth sebanyak 9,9 ml dan dikocok homogen maka diperoleh suspensi bakteri
dengan konsentrasi 10
6
CFUml. Dilakukan prosedur yang sama terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli dan Salmonella typhi
Depkes, 1995.
Universitas Sumatera Utara
35
3.13 Pembuatan Larutan Uji dengan Berbagai Konsentrasi
3.13.1 Pembuatan larutan uji ekstrak n-heksan, etilasetat, dan etanol
Sebanyak 1 gram ekstrak n-heksan dilarutkan dengan pelarut n-heksan hingga 2 ml maka konsentrasi ekstrak adalah 500 mgml kemudian dibuat
pengenceran. Selanjutnya larutan tersebut diencerkan kembali dengan ekstrak n-heksan dengan konsentrasi 400 mgml; 300 mgml; 200 mgml; 100 mgml;
90 mgml; 80 mgml ; 70 mgml; 60 mgml; 50 mgml; 40 mgml; 30 mgml; 20 mgml; 10 mgml; 9 mgml; 8 mgml; 7 mgml; 6 mgml; 5 mgml; 4 mgml;
3 mgml; 2 mgml; 1 mgml. Dilakukan prosedur yang sama terhadap ekstrak etilasetat dengan pelarut etilasetat dan ekstrak etanol dengan pelarut etanol.
3.14 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak n-Heksan, Etilasetat, dan
Etanol Daun Kembang Bulan.
Sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri konsentrasi 10
6
CFUml dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian ditambahkan 20 ml media MHA cair
45-50
o
C lalu dihomogenkan dan didiamkan hingga media memadat. Selanjutnya dibuat lubang dengan pencetak lubang dan diteteskan larutan
ekstrak mulai dari konsentrasi 500 mgml hingga pengenceran 10 mgml masing-masing 0,1 ml pada lubang dan sebagai kontrol diteteskan 0,1 ml
larutan n-heksan, etilasetat dan etanol 96. Ditutup cawan petri dan dibungkus. Didiamkan selama 10-15 menit kemudian diinkubasi pada suhu
37
o
C selama 18-24 jam. Setelah itu diukur diameter hambat pertumbuhan bakteri pada daerah bening di sekitar lubang dengan menggunakan jangka
sorong. Dilakukan prosedur yang sama terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli dan Salmonella typhi.
Universitas Sumatera Utara
36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan dilakukan oleh “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogoradalah tumbuhan kembang
bulan Tithonia diversifolia Hemsley A. Gray dari suku Asteraceae. Hasil dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 53.
4.2 Hasil Pemeriksaan Karakterisasi
Hasil pemeriksaan organoleptik daun kembang bulan segar yaitu daun berwarna hijau, berbau khas dan rasa pahit. Hasil pemeriksaan makroskopik
daun kembang bulan segar adalah daun tunggal, bertoreh sampai setengah panjang tulang daun, bergerigi, berseling, panjang daun 26-32 cm, lebar 15-25
cm, ujung dan pangkal daun runcing, pertulangan menyirip, berwarna hijau. Hasil pemeriksaan mikroskopik daun segar menunjukkan adanya rambut
penutup tunggal multiseluler, kutikula, epidermis atas, palisade, trakea bentuk spiral, jaringan bunga karang, epidermis bawah, dan mulut daun tipe diasitik.
Hasil pemeriksaan organoleptik simplisia adalah bewarna kuning kecoklatan, keriput, rapuh, berbau khas dan rasa pahit.Hasil pemeriksaan
makroskopik simplisia adalah berwarna kuning kecoklatan, keriput, rapuh, panjang daun 13-16 cm, lebar 5-10 cm. Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk
simplisia menunjukkan adanyarambut penutup tunggal multiseluler, trakea bentuk spiral, mulut daun tipe diasitik, pembuluh kayudan jaringan bunga
karang.
Universitas Sumatera Utara
