22
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Tempat Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi USU dan Balai Laboratorium Kesehatan Daerah Provinsi Sumatera
Utara, di jalan Wiliem Iskandar Pasar V Barat I No. 4 Medan.
3.2 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimental. Dengan tahapan meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, karakterisasi simplisia, skrining
fitokimia, pembuatan ekstrak n-heksan, etilasetat, dan etanol, serta uji aktivitas antibakteri secara in vitro dengan metode difusi agar menggunakan pencetak
lubang punch hole terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli dan Salmonella typhi.
3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, autoklaf Fisons, blender Philips, bola karet, desikator, cawan porselen berdasar rata,
freeze dryer Modulio, inkubator Fiber Scientific, jangka sorong, jarum ose, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF 1200L, lemari pendingin Toshiba,
mikroskop, neraca kasar Sun, neraca listrik Vibra AJ, oven Memmert, penangas air Yenaco, pinset, pipet mikro Eppendorf, rotary evaporator
Haake D, silinder logam, alat maserasi, alat destilasi air, kertas perkamen, aluminium foil, kertas saring, tissu dan kapas steril.
Universitas Sumatera Utara
23
3.3.2 Bahan
Bahan penelitian yang digunakan adalah daun kembang bulan, etanol 96 teknis, etanol 70 teknis, air suling, suspensi Mc. Farland, Mueller
Hinton Agar Difco, Nutrient agar Difco, larutan Nutrien Broth Difco, aquadest steril, biakan bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Staphylococcus epidermidis ATCC 25924, Eschericia coli ATCC 25922 dan, Salmonella typhi ATCC 25925.
Bahan kimia yang digunakan adalah berkualitas pro analisa yaitu £ naftol, asam klorida pekat, toluena, asam asetat anhidrida, asam asetat glasial, asam
nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismut III nitrat, etanol, etilasetat, n-heksan, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat,
kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium klorida, natrium sulfat anhidrat, raksa II klorida, serbuk magnesium dan timbal II asetat.
3.4 Penyediaan sampel 3.4.1 Pengumpulan bahan
Sampel yang digunakan adalah daun kembang bulan Tithonia diversifolia Hemsley A. Gray yang diperoleh dari Kecamatan
Siborong-borong, Kabupaten Tapanuli Utara, Provinsi Sumatera Utara. Pengambilan sampel dilakukan secara purposive yaitu tanpa membandingkan
dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain.
3.4.2 Identifikasi sampel
Identifikasi sampel dilakukan oleh “Herbarium Bogoriense”, Bidang
Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor.
Universitas Sumatera Utara
24
3.4.3 Pengolahan bahan
Daun kembang bulan dibersihkan dari kotoran dengan cara mencuci di bawah air mengalir hingga bersih dan ditiriskan, lalu ditimbang berat basah,
kemudian dikeringkan dalam lemari pengering pada suhu 40-50 C. Daun
kembang bulan dianggap kering apabila sudah rapuh, lalu ditimbang berat kering. Selanjutnya sampel diserbukkan dengan menggunakan blender, lalu
disimpan dalam wadah plastik di tempat yang terlindung dari cahaya sebelum digunakan.
3.5 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia 3.5.1 Pemeriksaan organoleptik
Pemeriksaan secara organoleptik meliputi pemeriksaan warna, bau dan rasa dari daun segar dan simplisia daun kembang bulan.
3.5.2 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari daun segar dan simplisia daun kembang bulan, dapat dilihat pada
Lampiran 2, halaman 54-55.
3.5.3 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun segar dan serbuk simplisia. Daun segar dipotong tipis secara melintang, kemudian letakkan di
atas kaca preparat lalu diteteskan larutan kloralhidrat dan dipanaskan diatas api bunsen kemudian ditutup dengan kaca penutup dan diamati di bawah
mikroskop. Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap
serbuk simplisia dengan cara menaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi
Universitas Sumatera Utara
25
dengan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian dilihat dibawah mikroskop. Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun
kembang bulan segar dan serbuk simplisia untuk melihat struktur anatomi
tumbuhan tersebut secara lengkap, dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 56. 3.5.4 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi Destilasi Toluena. Alat meliputi labu alas 500 ml, alat penampung, tabung penerima 5
ml berskala 0,05 ml, pendingin, tabung penyambung, pemanas. Cara kerja: Kedalam labu alas bulat di masukkan 200 ml toluen dan 2 ml air
suling, destilasi selama 2 jam, biarkan menjadi dingin selama 30 menit dan volume air dalam tabung penampung dibaca. Selanjutnya ke dalam labu
dimasukkan 5 gram serbuk simplisia lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur yaitu 2 tetesan per detik
sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin
dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penampung dibiarkan dingin sampai sama dengan suhu kamar.
Setelah air dan toluena memisah sempurna, dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan
kandungan air di dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992. Hasil dapat dilihat pada Tabel 4.2.1, halaman 39.
3.5.5 Penetapan kadar abu total
Sebanyak lebih kurang 2 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan
Universitas Sumatera Utara
26
ditara, kemudian diratakan. Krus dipijarkan pada suhu 600 C sampai arang
habis, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes,
1989. Hasil dapat dilihat pada Tabel 4.2.1, halaman 39.
3.5.6 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam
Abu yang telah diperoleh dari penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 ml asam klorida 2N selama 5 menit, bagian yang larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan pada suhu 600 C
sampai bobot tetap, didinginkan kemudian ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara
Depkes, 1989. Hasil dapat dilihat pada Tabel 4.2.1, halaman 39.
3.5.7 Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah dikeringkan diudara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air kloroform 2,5 ml kloroform dalam
air suling 1000 ml, dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring, sejumlah 20 ml
filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105
C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari yang larut di dalam air dihitung terhadap bahan yang telah
dikeringkan di udara Depkes, 1989. Hasil dapat dilihat pada Tabel 4.2.1, halaman 39.
3.5.8 Penetapan kadar sari larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat
Universitas Sumatera Utara
27
sambil dikocok sesekali 6 jam pertama dan dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat ditara. Sisanya dipanaskan dalam oven pada
105 C sampai diperoleh bobot konstan kadar sari yang larut didalam air
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Depkes, 1989. Hasil dapat dilihat pada Tabel 4.2.1, halaman 39.
3.6 Pembuatan Larutan Pereaksi
Pembuatan larutan pereaksi besi III klorida 1, Bouchardat, Dragendorff, Mayer, Molish, asam klorida 2 N, asam sulfat 2 N, kloralhidrat,
natrium hidroksida 2 N, Liebermann-Bouchard Timbal II asetat 0,4 M.
3.6.1 Besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml kemudian disaring.
3.6.2 Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling, ditambahkan iodium sebanyak 2 g dan dicukupkan dengan air suling
hingga 100 ml.
3.6.3 Dragendorff
Sebanyak 0,85 g bismut III nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 100 ml asam asetat glasial ditambahkan 40 ml air suling. Pada wadah
lain ditimbang 8 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling, lalu campurkan kedua larutan sama banyak, ditambahkan 20 ml asam asetat glasial
dan diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
28
3.6.4 Mayer
Sebanyak 1,35 g raksa II klorida dilarutkan dalam 60 ml air suling. Pada wadah lain sebanyak 5 g kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml air lalu
campurkan keduanya dan ditambahkan air suling hingga 100 ml.
3.6.5 Molish
Sebanyak 3 g £-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga volume 100 ml. Depkes, 1995
3.6.6 Asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat dilarutkan dalam air suling hingga volume 100 ml.
3.6.7 Asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,4 ml asam sulfat pekat kemudian diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.
3.6.8 Natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml.
3.6.9 Kloralhidrat
Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes, 1979.
3.6.10 Liebermann-Bouchard
Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 5 ml asam sulfat pekat kemudian ditambahkan etanol hingga 50 ml Harbone, 1987.
Universitas Sumatera Utara
29
3.6.11 Timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air bebas karbondioksida hingga 100 ml Depkes, 1989.
3.7 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia terhadap simplisia dan ekstrak n-heksan, etilasetat dan etanol daun kembang bulan meliputi pemeriksaan senyawa
steroidtriterpenoid, alkaloida, glikosida, flavonoid, saponin, dan tanin.
3.7.1 Pemeriksaan steroidtriterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada
sisanya ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Liebermann-Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah
yang berubah menjadi biru hijau menunjukkan adanya steroidtriterpenoid Farnsworth, 1966.
3.7.2 Pemeriksaan Alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan air selama 2 menit,
didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut : b.
Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer c.
Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat d.
Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendrof Alkaloida dianggap positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau tiga
dari percobaan diatas Depkes, 1995.
Universitas Sumatera Utara
30
3.7.3 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia sebanyak 3 g, lalu disaring dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2N, direfluks selama 2
jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu
disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan
pada temperatur tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan
dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara
perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan
adanya glikosida Depkes, 1978.
3.7.4 Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia kemudian ditambahkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, filtrat yang
diperoleh kemudian diambil 5 ml lalu di tambahkan 0,1 g serbuk Mg dan 1 ml HCl pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok, dan dibiarkan memisah. Flavonoid
positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.7.5 Pemeriksaan Saponin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan, kemudian
Universitas Sumatera Utara
31
dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes
asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes, 1978.
3.7.6 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2
ml larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 ttes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth,
1966.
3.8 Pembuatan ekstrak daun kembang bulan Tithonia diversifolia
Hemsley A. Gray.
Pembuatan ekstrak dilakukan secara perkolasi berkesinambungan menggunakan tiga pelarut. Cara kerja: sebanyak 250 gram serbuk simplisia
halus dimasukkan ke dalam wadah kaca dan dibasahi dengan n-heksan dalam wadah tertutup rapat, kemudian dimaserasi selama 3 jam. Massa dipindahkan
sedikit demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan dengan hati-hati, kemudian cairan penyari n-heksan dituangkan secukupnya sampai
cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Kran perkolator
dibuka dan diatur cairan menetes dengan kecepatan 1 mlmenit dan dipasang reservoir penyari sehingga tetap dapat dipertahankan selapis cairan penyari
diatas serbuk simplisia sampai cairan yang keluar tidak berwarna lagi atau cairan yang terakhir keluar bila diuapkan tidak meninggalkan sisa Depkes,
2000. Perkolat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan alat rotary
Universitas Sumatera Utara
32
evaporator setelah itu diuapkan hingga diperoleh ekstrak kental dan ditimbang. Kemudian ampasnya dikeringkan lalu diperkolasi kembali dengan
menggunakan pelarut berturut-turut etilasetat dan etanol 70, prosedur dilakukan sama seperti yang diatas.
3.9. Sterilisasi Alat dan Bahan
Kategori