Pemeriksaan Makroskopik Umbi Bawang Sabrang Pembuatan Ekstrak Isolasi Senyawa Antrakuinon dari Ekstrak Etanol Analisis Fraksi Etilasetat dengan cara Kromatografi Lapis Tipis KLT

lalu dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kemudian keduanya dicampur dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes, 1989.

3.3.7 Pereaksi Molish

Sebanyak 3 g alfa naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 ml Depkes, 1979.

3.3.8 Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 N

Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml Depkes, 1989.

3.3.9 Pereaksi Liebermann-Burchard

Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrid dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat Harborne, 1987.

3.3.10 Pereaksi Kalium Hidroksida 10

Sebanyak 10 g kalium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam etanol hingga 100 ml Wagner, et al., 1984.

3.4 Pemeriksaan Makroskopik Umbi Bawang Sabrang

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar, warna, bau, rasa, ukuran dari umbi bawang sabrang Eleutherine palmifolia L. Merr. Universitas Sumatera Utara 3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia 3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari simplisia umbi bawang sabrang Eleutherine palmifolia L. Merr.

3.5.2 Penetapan Kadar Air

Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluen. Dimasukkan 200 ml toluen dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat, lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluen dibiarkan mendingin selama 30 menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa World Health Organization, 1992. Kadar air dihitung dalam persen. Rumus perhitungan kadar air serbuk simplisia sebagai berikut : Kadar air = 100 x sampel berat awal volume akhir volume − Universitas Sumatera Utara

3.5.3 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Air

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105 o 100 x 20 100 x g sampel berat g sari berat C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1989. Rumus perhitungan kadar sari larut dalam air serbuk simplisia sebagai berikut : Kadar sari larut dalam air =

3.5.4 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Etanol

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 95 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105 o 100 x 20 100 x g sampel berat g sari berat C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 95 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1989. Rumus perhitungan kadar sari larut dalam etanol serbuk simplisia sebagai berikut : Kadar sari larut dalam etanol = Universitas Sumatera Utara

3.5.5 Penetapan Kadar Abu Total

Sebanyak 2 g serbuk yang telah dihaluskan dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, lalu diratakan. Krus dipijarkan pada suhu 600ºC sampai arang habis, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1989. Rumus perhitungan kadar abu total serbuk simplisia sebagai berikut : Kadar abu total = 100 x g sampel berat g abu berat

3.5.6 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam

Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu kemudian dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 600ºC sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan Depkes, 1989. Rumus perhitungan kadar abu tidak larut dalam asam serbuk simplisia sebagai berikut : Kadar abu tidak larut dalam asam = 100 x g sampel berat g abu berat 3.6 Skrining Fitokimia 3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang kemudian ditambahkan 10 ml asam klorida 0,2 N, dipanaskan di atas penangas air selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung Universitas Sumatera Utara reaksi, lalu kedalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi : i. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer ii. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff iii. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga percobaan diatas Depkes, 1989.

3.6.2 Pemeriksaan Flavonoid

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang kemudian ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring. Filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambahkan 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, lalu diamkan sebentar. Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40ºC, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etilasetat, disaring. Filtratnya digunakan untuk uji flavonoid dengan cara berikut: i. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol 95 , kemudian ditambah 0,5 g serbuk Zn dan 2 ml asam klorida 2 N, didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat. Jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid. ii. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol 95 , lalu ditambah 0,1 g serbuk Mg dan 10 tetes asam klorida pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai warna merah ungu menunjukkan adanya flavonoid Depkes, 1989. Universitas Sumatera Utara

3.6.3 Pemeriksaan Glikosida

Sebanyak 3 g serbuk simplisia ditimbang kemudian disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Pada kumpulan sari ditambahkan natrium sulfat anhidrat dan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 ٥ C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut : i. 0,1 ml larutan percobaan diuapkan, ditambahkan 5 ml asam asetat anhidrid dan 10 tetes asam sulfat pekat. ii. 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan glikosida. iii. Serbuk sampel direbus dalam air, didinginkan, disaring. Pada filtrat ditambahkan fehling A dan fehling B 1:1, dipanaskan. Terbentuknya endapan merah bata menunjukkan adanya gula pereduksi Depkes, 1989.

3.6.4 Pemeriksaan Saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak Universitas Sumatera Utara kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes, 1989.

3.6.5 Pemeriksaan Glikosida Antrakuinon

Serbuk ditimbang sebanyak 0,2 g, ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzen dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzen tidak berwarna menunjukkan adanya antrakuinon Depkes, 1989.

3.6.6 Pemeriksaan Glikosida Sianogenik

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam erlenmeyer, dilembabkan dengan air suling. Diselipkan kertas saring yang telah dibasahi natrium pikrat pada mulut erlenmeyer, ditutup, dibiarkan terkena sinar matahari. Jika kertas saring memberikan warna merah, menunjukkan adanya sianogenik glikosida Depkes, 1989.

3.6.7 Pemeriksaan Tanin

Sebanyak 1 g serbuk simplisia ditimbang, dididihkan selama 3 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1- 2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.

3.6.8 Pemeriksaan TriterpenoidSteroid

Sebanyak 1 g serbuk simplisia ditimbang, dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard. Terbentuknya warna ungu Universitas Sumatera Utara atau merah yang berubah menjadi merah ungu atau biru hijau menunjukkan adanya triterpenoidsteroid Farnsworth, 1966.

3.7 Pembuatan Ekstrak

Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 80 Farnsworth, 1966. Sebanyak 650 g serbuk kering umbi bawang sabrang dimaserasi dengan pelarut etanol 80 sampai seluruh serbuk terendam, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil sesekali diaduk Depkes, 1986. Kemudian disaring sehingga didapat maserat. Ampas dimaserasi kembali dengan etanol 80 menggunakan prosedur yang sama, maserasi dilakukan sebanyak 3 kali. Seluruh maserat digabung dan dipekatkan dengan bantuan alat rotary evaporator pada temperatur tidak lebih dari 40 °C sampai diperoleh ekstrak kental.

3.8 Isolasi Senyawa Antrakuinon dari Ekstrak Etanol

Sebanyak 50 g ekstrak etanol kental ditambah pelarut etanol 80 sampai larut kemudian difraksinasi dengan pelarut etilasetat, hasilnya diperoleh fraksi etilasetat dan fraksi air. Kemudian fraksi etilasetat dipekatkan di atas penangas air sehingga diperoleh fraksi etilasetat kental. Bagan ekstraksi dan isolasi senyawa antrakuinon dari umbi bawang sabrang dapat dilihat sebagai berikut : Universitas Sumatera Utara Serbuk simplisia Ampas Maserat Ekstrak etanol kental difraksinasi dengan etilasetat Fraksi air Fraksi etilasetat dipekatkan diatas penangas air Fraksi etilasetat kental Ampas dimasukkan ke dalam wadah ditambahkan etanol 80 sampai serbuk terendam sempurna dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil sesekali diaduk disaring Maserat dimaserasi kembali dengan pelarut etanol 80 disaring diuapkan dengan penguap rotary evaporator pada 40ºC Universitas Sumatera Utara

3.9 Analisis Fraksi Etilasetat dengan cara Kromatografi Lapis Tipis KLT

Fraksi etilasetat yang diperoleh dianalisis dengan cara KLT menggunakan plat pra lapis silika gel GF 254 dengan berbagai macam fase gerak yaitu petroleum eter-etilasetat-asam formiat 75:25:1, petroleum eter-etilasetat-air 75:25:1 dan etilasetat-metanol-air 100:17:13 Wagner, et al., 1984. Benzen-aseton 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, kloroform-etilasetat 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5 dan n.propanol-etilasetat 8:2, 7:3, 5:5, 3:7. Sebagai penampak bercak adalah pereaksi kalium hidroksida KOH 10 dalam etanol. Fraksi etilasetat ditotolkan pada plat pra lapis silika gel GF 254 kemudian dimasukkan ke dalam chamber yang masing-masing telah dijenuhkan dengan uap fase gerak dan ditutup rapat. Setelah elusi selesai plat dikeluarkan dari chamber, dikeringkan kemudian plat disemprot dengan penampak bercak KOH 10, warna bercak yang terjadi diamati dan dihitung harga Rf-nya.

3.10 Pembuatan Plat KLT Preparatif