15. Pipet tetes
3.2.2. Bahan-bahan yang Digunakan
1. Daun kari yang segar 2. Dietil eter p.a. E.Merck
3. Aquades 4. Na
2
SO
4
anhidrat p.a E.Merck 5. Etanol 95 p.a. E.Merck
3.3 Prosedur Kerja 3.3.1. Isolasi minyak atsiri dari daun kari
1.
Sebanyak 250 gram daun kari yang telah dipotong hingga halus dimasukkan ke dalam labu alat Stahl 500 ml dan ditambahakan aquadest hingga 500 ml.
2. Lalu kondensor Stahl dialiri air.
3.
Kemudian labu destilasi Stahl dipanasi dengan penangas bermedium minyak selama 5 jam pada suhu 100
C.
4. Destilat ditampung dengan gelas Erlenmeyer lalu dimasukkan ke dalam
corong pisah.
5. Tambahkan 10 ml eter ke dalam corong pisah lalu dikocok-kocok dan
didiamkan lebih kurang 10 menit, hingga terbentuk dua lapisan yaitu minyak dan eter di sebelah atas dan air di bagian bawah.
6.
Minyak dan eter ditampung di tabung reaksi, dan biarkan beberapa jam hingga eter menguap sehingga yang tinggal hanya minyak atsiri.
7. Ke dalam minyak atsiri yang sudah terbebas dari eter kemudian ditambahkan
sedikit Na
2
SO
4
anhidrat untuk menyerap sisa air yang masih terkandung pada minyak,diamkan selama 1 jam .
8. Saring
9. Filtrat kemudian dipisahkan untuk dianalisa komponen kimianya dan diuji
kemampuan aktivitas anti bakterinya.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Uji Aktivitas Anti Bakteri 3.4.1. Alat dan Bahan
3.4.1.1. Alat yang digunakan
Inkubator suhu 37°C, timbangan elektrik Analytical Balance Denver Instrument, autoklaf, hot plate-stirer, laminar air flow, jangka sorong, mikro pipet digital 2-
20 μl, 20-
200 μl dan 100-1000 μl, cawan petri, botol duran, jarum ose, pembakar spirtus, perforator diameter 6 mm, yellow tip,blue tip dan spatula logam.
3.4.1.2 Bahan yang digunakan
a. Bahan penelitian Bahan penelitian yang digunakan adalah minyak atsiri daun kari Murraya
koenigii L. yang diperoleh dari daerah Kecamatan Medan Sunggal, Sumatera Utara.
b. Bahan Kimia Aquades, Na
2
SO
4
anhidrat, DMSO, buffer phospat pH 7, alkohol 70 c. Bakteri Uji
Bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus, Salmonella typhi dan Escherichia coli.
d. Media Bakteri Media pertumbuhan bakteri yang digunakan adalah Mueller Hinton Agar MHA
dan Nutrien Agar NA . e. Zat pembanding Antibakteri
Zat pembanding yang digunakan adalah amoksisilin.
3.4.2. Uji aktivitas antibakteri minyak atsiri
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode Difusi Agar dengan tahap kerja sebagai berikut :
a. Sterilisasi alat
Universitas Sumatera Utara
Alat yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilkan dalam autoklaf dengan temperatur 121ºC selama kurang lebih 20 menit.
b. Pembuatan Media Agar Miring NA Nutrien Agar ditimbang sebanyak 2.3 g kemudian dilarutkan dalam 100 ml
aquades, dipanaskan diatas hotplate stirer sampai mendidih dan terbentuk larutan agar yang berwarna kuning bening. Larutan agar tersebut dimasukkan kedalam 10
tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml dan ditutup dengan kapas serta alumunium foil. Tabung yang berisi agar disterilisasi pada suhu 121ºC selama 20
menit. Selanjutnya ditempatkan pada rak miring dan didiamkan sampai pada suhu kamar.
c. Pembuatan biakan bakteri Sebanyak 1 ose isolat bakteri digoreskan pada media miring agar NA dengan pola
zig-zag, masing-masing bakteri dibuat 3 biakan bakteri. Proses ini dilakukan dalam keadaan steril pada ruang isolasi dengan sinar UV. Biakan diinkubasi pada
suhu 37 ºC selama 18 sampai 24 jam. d. Pengenceran bakteri Staphylococcus Aureus, Escherichia coli dan Salmonella
typhi. Disediakan 10 mL NaCl 0,9 steril masing
– masing bakteri Staphylococcus Aureus,Escherichia coli dan Salmonella Typii dengan menggunakan jarum ose
pada media NA Nutrien Agar miring ke dalam NaCl 0,9 steril sampai kekeruhannya sama dengan suspense standar Mc. Farland, maka konsentrasi
bakteri adalah 10
8
koloniml. e. Pembuatan variasi konsentrasi minyak atsiri daun kari Murraya koenigii L.
Dengan variasi konsentrasi 6.25, 12.5, dan 25 f. Pembuatan Media MHA Mueller Hinton Agar
Media MHA Mueller Hinton Agar ditimbang sebanyak 5,7 g kemudian dilarutkan dalam 150 ml aquades, dipanaskan, distirer di atas hotplate stirer
sampai mendidih sehingga terbentuk larutan agar yang berwarna kuning bening.
Universitas Sumatera Utara
Larutan Mueller Hinton Agar tersebut dimasukkan kedalam cawan petri disterilisasi di dalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 20 menit.
g. Uji aktivitas antibakteri minyak atsiri Dalam pengujian minyak atsiri daun kari, digunakan perporator dengan diameter
6 mm untuk membuat sumuran. Dituangkan sebanyak 15 ml media Mueller Hinton Agar MHA ke dalam cawan Petri steril dan dibiarkan memadat, begitu
juga dengan media Potato Dekstro Agar PDA. Dicelupkan cotton bud steril pada suspensi mikroba uji dan diusapkan secara perlahan-lahan pada permukaan media
secara merata, selanjutnya dibiarkan mengering selama beberapa menit. Setelah padat dibuat sumuran dengan jarak antar lubang sama. Larutan minyak atsiri
dibuat dengan konsentrasi 6,25, 12.5, 25 didalam DMSO dan 0 sebagai kontrol. Masing-
masing dipipet sebanyak 10 μl selanjutnya diteteskan kedalam sumuran. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37
o
C 18 – 24 jam. Aktivitas ekstrak
tumbuhan dapat dilihat dengan adanya zona hambat daerah bening di sekitar cakram. Diukur diameter zona hambat dengan menggunakan jangka sorong. Uji
aktivitas anti bakteri daun kari Murraya koenigii L. terhadap bakteri Staphylococcus Aureus, Escherichia coli, dan Salmonella typhi.
Indeks Anti Bakteri = Diameter Zona hambat mm – Diameter Cakrammm
Diameter Cakram mm h. Penentuan daya kerja antimikrobial amoksilin
Penentuan daya kerja antimikrobial amoksilin ditetapkan dengan caya yang sama dengan penentuan daya kerja antibakterial minyak atsiri. Variasi konsentrasi
amoksilin dibuat dengan melarutkannya dalam buffer posfat pH 7.
Universitas Sumatera Utara
33
3.5. Bagan Penelitian
Daun kari Murraya koenigii. L
D irajang digunting
Ditimbang Irisan daun kari
Destilasi dengan alat Stahl
Minyak Atsiri bersama Air
Diekstraksi dengan Eter
Lapisan eter bersama minyak atsiri Lapisan minyak dan sedikit minyak
Diuapkan eternya Ditambah eter
dan diuapkan eternya
Minyak atsiri + Na
2
SO
4
anhidrat Minyak atsiri + Na
2
SO
4
anhidrat
Disaring Disaring
Filtrat minyak atsiri Filtrat minyak atsiri
Analisa GC-MS dan uji anti bakteri
Universitas Sumatera Utara
34
Bagan Uji Anti Bakteri Penyiapan Mikroba Uji
Disubkultur dengan menggunakan media miring
dinkubasi pada suhu 37 ºC selama 18 -24 jam
Disuspensikan dalam larutan NaCl 0,9 steril sehingga diperoleh kekeruhan
standart Mc. Farland dilakukan pengenceran 10
-2
sehingga diperoleh suspensi 10
6
cfuml
Uji Aktivitas Anti Bakteri Daun Kari
Murraya koenigii L.
dituang ke dalam cawan petri steril dibiarkan memadat
diusapkan suspensi biakan dengan cotton bud
dibuat sumuran masukan minyak atsiri kosentrasi berbeda
diletakkan sampel pembanding diinkubasi selama 18-24 jam
diamati dan diukur zona bening di sekitar sumuran
Isolat Mikroba Uji
Suspensi Mikroba Uji
Media MHA
Media Uji
Hasil
Universitas Sumatera Utara
35
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian 4.1. 1 Hasil Isolasi Minyak Atsiri daun Kari
M. koenigii L.
Isolasi minyak atsiri daun kari M. koenigii L. pada penelitian ini dilakukan dengan cara penyulingan dengan air hidrodestilasi. Proses penyulingan dengan sistem ini
dilakukan dengan memasukkan bahan baku daun segar yang telah dipotongdirajang ke dalam labu alat destilasi Sthal yang di isi air kemudian dipanaskan.
Destilasi Stahl adalah alat untuk mengukur kadar rendemen minyak atsiri dari simplisia tanaman, ekstrak. Dipakai juga untuk menyuling minyak atsiri dalam
skala kecil atau penetapan kadar minyak atsiri guna keperluan praktikum di laboratorium pendidikan, penelitian dan pengujian. Terbuat dari bahan pyrexglass
berkualitas sesuai standar SNI.
Prinsip kerja destilasi Stahl yaitu bahan yang didestilasi kontak langsung dengan air mendidih sehingga terjadi hidrodifusi atau penembusan air pada jaringan-
jaringan tanaman. Kelenjar yang terpecah oleh uap air menyebabkan minyak atsiri lepas dan terbawa bersama-sama uap air. Uap air yang membawa minyak atsiri
tersebut kemudian didinginkan dalam kondensor. Hasil pendinginan akan diperoleh lapisan minyak atsiri yang terpisah oleh air. Minyak atsiri yang masih bercampur
dengan sedikit air ditambah dengan natrium sulfat anhidrat untuk mengikat sisa-sisa air sehingga diperoleh minyak atsiri. Minyak atsiri yang diperoleh dari hasil
penelitian ini berupa cairan berwarna kuning jernih dan berbau khas. Minyak atsiri yang diperoleh dengan cara penyulingan destilasi air dihasilkan 3 ml, sedangkan daun
kari segar digunakan 750 gram.
Universitas Sumatera Utara
4.2. Hasil Analisa Kromatograpi Gas-Mass Spektra GC-MS
Minyak atsiri yang diperoleh secara penyulingan destilasi air, dianalisa dengan Kromatografi Gas-Spektrofotometri Massa GC-MS. Kromatogram GC dari minyak
atsiri daun Kari M. koenigii L. menunjukkan 16 spektrum diperlihatkan pada gambar 4.1, dengan waktu retensi RT yang berbeda-beda.
Gambar 4.1 Kromatogram MS Minyak Atsiri dari Daun Kari
Universitas Sumatera Utara
Identifikasi komponen lebih lanjut dilakukan dengan spektrometer massa, dari hasil spektrometer massa akan diperoleh spektra massa dari masing-masing puncak
yang terdeteksi pada kromatogram GC. Analisa spectra massa didasarkan pada nilai Similarity Indeks SI, base peak puncak dasar, dan trend pecahan spectra massa
yang dibandingkan dengan spectra dari library yaitu Wiley 8.LIB. Spectra massa senyawa yang teridentifikasi dan spectra massa senyawa standar dari Wiley 8.LIB
dapat dilihat pada lampiran 1 Berikut ini adalah 9 komponen senyawa hasil analisis minyak atsiri daun Kari
dari Kecamatan Medan Sunggal dengan GC-MS yang di tunjukkan pada tabel 4.1.
Tabel 4.1 Komposisi Senyawa Kimia dalam Minyak Atsiri Daun Kari
No Waktu
Retensi menit
Nama Senyawa
Rumus Molekul
Kualitas Kemiripan
Kandungan Senyawa
1 9,604
Sabinena C
10
H
16
95 3,94
2 21,158
β-Elemena C
15
H
24
93 3,61
3 22,032
Trans-Kariofilen C
15
H
24
94 29,19
4 22,928
α - Humulena C
15
H
24
93 5,49
5 23,817
Trans-Kariofilen C
15
H
24
91 7,46
6 24,056
Germacrena A C
15
H
24
91 11,40
7 26,356
Kariofilen oksida C
15
H
24
O 91
21,94 8
9 26,969
28,055 Spiro 4,5 decana
Veridiflorol C
10
H
18
C
15
H
26
O 85
84 3,35
4,22
Komposisi senyawa kimia dalam minyak atsiri daun kari diatas menunjukkan perbedaan dari hasil penelitian yang telah dilakukan sebelumnya di Negara lain,
dimana ada 39 komponen berbeda yang terdapat pada daun kari yang diperoleh dari Bangladesh dan India yang sebagain besar terdiri dari 3-carene 54,2, dan
kariofilen 9,5 Chowdhury, J.U,et al, 2008. Hal ini dapat disebabkan antara lain oleh perbedaan kadar unsur hara dan kadar air yang terdapat didalam tanah, iklim,
cuaca, dan faktor lain karena perbedaan letak geografis dari Negara tempat tanaman tumbuh.
Universitas Sumatera Utara
Adapun data MS yang diidentifikasi adalah sebagai berikut: 1. Data hasil analisa MS untuk senyawa RT 9.604 menit memberikan fragmentasi
dengan puncak ion molekul pada me 136 diikuti puncak-puncak fragmen dengan massa me sebagai berikut :136, 121, 107, 93, 77, 69, 53, dan 41 lampiran 4-line
3. 2. Data hasil analisa MS untuk senyawa dengan RT 21.158 menit memberikan
fragmentasi dengan puncak ion molekul pada me 204 diikuti puncak-puncak fragmen dengan massa me sebagai berikut : 189, 175, 161, 147, 133, 107, 93, 53,
dan 41 lampiran 6-line 5. 3. Data hasil analisa MS untuk senyawa RT 22.032 menit memberikan fragmentasi
dengan puncak ion molekul pada me 204 diikuti puncak-puncak fragmen dengan massa me sebagai berikut : 189, 175, 161, 147, 133, 120, 105, 91, 79, 69, 53, dan
41 lampiran 7-line 6. 4. Data hasil analisa MS untuk senyawa RT 22.928 menit memberikan fragmentasi
dengan puncak ion molekul pada me 204 diikuti puncak-puncak fragmen dengan massa me sebagai berikut :204, 189, 161, 147, 136, 121, 107, 93, 80, 67, 55, dan
41 lampiran 9-line 8. 5. Data hasil analisa MS untuk senyawa RT 23.817 menit memberikan fragmentasi
dengan puncak ion molekul pada me 204 diikuti puncak-puncak fragmen dengan massa me sebagai berikut :204, 189, 175, 161, 148, 133, 120, 107, 93, 79, 69, 55,
dan 41 lampiran 10-line 9. 6. Data hasil analisa MS untuk senyawa RT 24.056 menit memberikan fragmentasi
dengan puncak ion molekul pada me 204 diikuti puncak-puncak fragmen dengan massa me sebagai berikut : 204, 189, 175, 161, 147, 133, 119, 107, 93, 81, 68, 53
dan 41 lampiran 11-line 10. 7. Data hasil analisa MS untuk senyawa RT 26.356 menit memberikan fragmentasi
dengan puncak ion molekul pada me 220 diikuti puncak-puncak fragmen dengan massa me sebagai berikut :161,149,135,121,109,93,79,69, dan 41 lampiran 13-
line 12.
Universitas Sumatera Utara
8. Data hasil analisa MS untuk senyawa RT 26.969 menit memberikan fragmentasi dengan puncak ion molekul pada me 138 diikuti puncak-puncak fragmen dengan
massa me sebagai berikut :138, 123, 109, 96, 81, 67, 55, dan 41 lampiran 14- line 13.
9. Data hasil analisa MS untuk senyawa RT 28.055 menit memberikan fragmentasi dengan puncak ion molekul pada me 222 diikuti puncak-puncak fragmen dengan
massa me sebagai berikut : 204, 189, 161, 147, 135, 121, 109, 93, 81, 69, 43 dan 41 lampiran 16 - line 15.
4.3 Pembahasan GC-MS 4.3.1 Analisa Spektrum MS Minyak atsiri dari Daun kari
1. Puncak dengan RT 9.064 menit merupakan senyawa dengan rumus molekul
C
10
H
16
adalah data spektrum massa menunjukkan ion molekul me 136. Dengan membandingkan data spektrum yang diperoleh dari data spektrum
library yang lebih mendekati adalah Sabinena dengan luas area 908944 sebanyak 3,94 dengan ketinggian 236013 gambar 4.2.
a.
b.
Universitas Sumatera Utara
Keterangan : a = sampel b = standard library
Gambar 4.2 Spektrum MS senyawa Sabinena dengan RT 9.604 menit Bila disesuaikan dengan data library WILEY229.LIB, maka kemungkinan
fragmentasinya adalah sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
i - Pr
CH
2
CH
3
-CH-CH
3
CH
2
CH
3
- C-H
CH
2
+
-
.
CH
3
15
me = 136 C
10
H
16
e - 2e
+
.
me = 121 C
9
H
13
CH
2
+
-CH
2
14 -
CH
2
14
CH
2
me = 107 C
8
H
11
CH
2
+
me = 93 C
7
H
9
Gambar 4.3 Pola Fragmentasi senyawa Sabinena C
10
H
16
Hasil MS memberikan puncak ion molekul pada me = 136. Ion dengan me= 136 mengalami fragmentasi dengan melepas CH
3
, membentuk ion me = 121. Ion me= 121 melepaskan CH
2
membentuk ion me= 107. Ion me = 107 mengalami fragmentasi dengan melepaskan CH
2
membentuk ion dengan me= 93. Akhirnya diperoleh ion molekul dengan me= 93.
Universitas Sumatera Utara
2. Puncak dengan RT 21.158 menit dengan luas area 831770 sebanyak 3,61
