Cairan plasma darah yang telah terpisah dari bagian padat darah segera dipindahkan ke tabung mikrosentrifuge kosong NWLSS
TM
Malondialdehyde Assay.
3.6.2 Pengukuran Kadar MDA Plasma
Pengukuran kadar MDA plasma dilakukan menurut metode yang digunakan Rao dan kawan-kawan dalam Hsieh dan kawan-kawan dan metode NWLSS
TM
Malondialdehyde Assay yang telah dimodifikasi. Alat dan bahan yang diperlukan: pipet 10, 200
µL, pipet tip, stir bar, tabung mikrosentrifugasi polipropilena, semi- mikro
kuvet, spektrofotometer, vorteks, magnetic stirrer, water bath,
mikrosentrifugasi, 2-thiobarbituric acid, asam asetat glasial, natrium hidroksida, malondialdehida bis dan aquabides.
Persiapan reagensia dimulai dengan membuat reagensia TBA thiobarbituric acid dengan melarutkan 0,67 g 2 thiobarbituric acid dalam 100 ml aquabidest,
kemudian ditambahkan 0,5 g natrium hidroksida dan 100 ml asam asetat glasial. Selanjutnya membuat larutan serial standar dari larutan stok MDA 125
µM yang dilarutkan dalam aquabides, seperti dapat dilihat pada tabel di bawah ini:
T.Helvi Mardiani : Pengaruh Pemberian Timbal Pb Terhadap Kadar Malondialdehyde MDA Plasma Dan Jumlah Eritrosit Mencit, 2008.
USU Repository © 2008
Tabel 2. Persiapan MDA Standar untuk Spektrofotometer Nomor Standar
Konsentrasi MDA Volume MDA
Volume Standar
µM 125
µM µl aquabides
µl 8
50 400
600 7
25 200
800 6
10 80
920 5
5 40
960 4
2,5 20
980 3
1,25 10
990 2
0,625 5
995 1
1000 __________________________________________________________________
Setelah diperoleh delapan larutan serial standar MDA dengan konsentrasi yang berbeda, semua standar ini kemudian diproses sebagaimana prosedur pembuatan
sampel untuk pengukuran kadar malondialdehyde pada spektrofotometer, untuk mendapatkan kurve standar MDA yang akan menjadi faktor kali pengukuran kadar
MDA sampel.
Gambar 3. MDA Standar untuk Spektrofotometer
Keterangan: dari kiri ke kanan, tabung 1: larutan standar 0
µM, tabung 2: larutan standar 0,625
µM, tabung 3: larutan standar 1,25 µM, tabung 4: larutan standar 2,5 µM, tabung 5: larutan standar 5 µM, tabung 6: larutan standar 10 µM, tabung 7:
larutan standar 25 µM, tabung 8: larutan standar 50 µM.
T.Helvi Mardiani : Pengaruh Pemberian Timbal Pb Terhadap Kadar Malondialdehyde MDA Plasma Dan Jumlah Eritrosit Mencit, 2008.
USU Repository © 2008
Prosedur kerja: sebanyak 100 µl sampel plasma darah atau standar
dimasukkan dalam tabung mikrosetrifuge yang telah dilabel. Pada masing-masing tabung ditambahkan aquabidest 0,9 ml. Pada sampel atau standar tersebut,
selanjutnya ditambahkan TBA reagent 0,5 ml. Tabung berisi larutan kemudian dipanaskan di dalam waterbath pada suhu 95
C selama 1 jam, selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 7000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh
diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 534 nm.
Gambar 4. Pemanasan Larutan Sampel dalam Waterbath
3.6.3 Penghitungan Jumlah Eritrosit
