Waktu Dan Tempat Alat Dan Bahan Rancangan Penelitian Prosedur Penelitian

BAB 3 BAHAN DAN METODE

3.1 Waktu Dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni 2015 sampai dengan September 2015 di Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam FMIPA dan Laboratorium Mikrobiologi FMIPA, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.2 Alat Dan Bahan

Alat yang digunakan adalah timbangan analitik, timbangan meja, rotary evaporator , cawan Petri, Erlenmeyer, autoklaf, inkubator, mikroskop, blender, gelas piala, gelas ukur, spatula, magnetic stirrer, oven, spatula, handspray, bunsen, jarum ose dan pipet serologi. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun seri, isolat Streptococcus mutans, Escherichia coli, dan C. albicans,cotton bud , aquadest, alkohol 70, media sabouraud dextrose agar SDA, Mueller Hinton Agar MHA, nutrient agar NA,NaCl 0,9 , kloramfenikol, ketokonazol, dimethilsulfoxyde DMSO, etanol, metanol, kloroform, n-heksan, pereaksi Wagner, Meyer, Salkowasky, Lieberman-Bouchard, Dragendroff, FeCl 3 , MgHCl, NaOH 10, H 2 SO 4 p, Bouchardat, CeSO 4 1, dan H 2 SO 4 10.

3.3 Rancangan Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL Faktorial dengan 2 faktor yaitu: faktor I meliputi konsentrasi ekstrak etanol daun seri Muntingia calabura Linn., masing-masing terdiri dari: kontrol positif K1, kontrol negatif K2, 5 K3, 10 K4, 15 K5, 20 K6 dan 25 K7, serta faktor II meliputi spesies mikroorganisme uji terdiri dari S. mutans M1, E. coli M2 dan C. albicans M3. Masing-masing perlakuan diulangi sebanyak 3 kali. Data yang diperoleh selanjutnya dianalisa dengan one- way Analysis of Variance ANOVA. Jika perlakuan berpengaruh nyata maka Universitas Sumatera Utara dilanjutkan dengan dianalisis dengan uji Duncan pada taraf 5 dengan bantuan software SPSS ver. 21.Lihat Lampiran 7 halaman 42.

3.4 Prosedur Penelitian

Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu pembuatan ekstrak dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol, uji skrining fitokimia, dan pengujian aktivitas antimikroba oleh daunseri.

3.4.1 Ekstraksi Tumbuhan dengan Metode Maserasi

Satu kilogram daun seri dikeringanginkan selama ± 1 minggu. Masing-masing sampel lalu diblender. Sampel yang telah halus direndam dengan menggunakan etanol dalam botol selama 3 hari pada suhu ruangan. Setelah 3 hari pemaserasian, maserat kemudian disaring, filtrat kemudian dipisahkan dan ampasnya direndam kembali dengan menggunakan etanol yang baru, maserasi dilakukan ± 3 kali dengan menggunakan kertas saring hingga diperoleh maserat yang terakhir berwarna jernih dan dipekatkan dalam rotari evaporator pada suhu didih etanol Ginting, 2008. Hasilnya akan diperoleh ekstrak kental masing-masing sampel. Masing-masing ekstrak kental dimasukkan dalam botol vial.Ekstrak yang diperoleh disimpan di dalam botol gelap dan disimpan pada suhu refrigerator. Lihat Lampiran 1 halaman 36.

3.4.2 Uji Skrining Fitokimia

Uji skrining fitokimia daun seri yang akan dilakukan meliputi pemeriksaan kandungan senyawa flavanoid, alkaloid, steroid dan terpenoid. Pemeriksaan senyawa ini sesuai dengan prosedur yang telah dilakukan Harbone 1987, yaitu: 1. Uji Flavonoid Daun serikering yang telah dihaluskan dimasukkan sebanyak 3 g ke dalam Erlenmeyer yang berisi 100 ml metanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal, lalu disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi FeCl 3, tabung II ditetesi MgHCl, tabung III ditetesi H 2 SO 4p dan tabung 4 ditetesi NaOH 10. Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi dan diamati hasilnya. Universitas Sumatera Utara 2. Uji Alkaloid Daun seri yang telah kering kemudian dihaluskan dan dimasukkan sebanyak 3 g ke dalam Erlenmeyer yang berisi 100 ml metanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal, lalu disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Meyer , tabung II ditetesi pereaksi Wagner, tabung III ditetesi Bouchardat dan tabung 4 ditetesi Dragendrof. Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi dan diamati hasilnya. 3. Uji Steroid Daunseri yang telah dihaluskan dimasukkan sebanyak 3 g ke dalam Erlenmeyer yang berisi 100 ml n-heksan. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal, lalu disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO 4 dalam H 2 SO 4p 10 , tabung II ditetesi reagen Salkowsky H 2 SO 4 dan tabung III ditetesi Liebermen- Bouchard. Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi dan diamati hasilnya. 4. Uji Terpenoid Daun seri kering yang telah dihaluskan dimasukkan sebanyak 3 g ke dalam Erlenmeyer yang berisi 100 ml kloroform. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal. Kemudian disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO 4 dalam H 2 SO 4p 10 , tabung II ditetesi reagent Salkowsky H 2 SO 4p , tabung III ditetesi Liebermen Bouchard.Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi dan diamati hasilnya. 3.4.3 Penyiapan Mikroba Uji Mikroba uji Streptococcus mutans, Escherichia coli, dan Candida albicans diperoleh dari laboratorium Mikrobiologi FMIPA, USU. Mikroba uji tersebut dibuat suspensinya dengan mengambil koloni mikroba uji, lalu dimasukkan ke dalam larutan NaCl 0,9 dan disesuaikan dengan kekeruhan Mc. Farland 1x10 8 CFUml. Diambil 0,1 ml, suspensi mikroba uji ini dimasukkan ke dalam tabung steril kemudian ditambahkan 9,9 ml larutan NaCl 0,9, divortex sampai Universitas Sumatera Utara homogen, sehingga diperoleh suspensi mikroba 10 6 CFUml Fatimah dkk, 2006. Lihat Lampiran 2 halaman 37. 3.4.4 Uji Aktivitas Antimikroba Ektrak Etanol Daun dan Buah Seriterhadap Pertumbuhan Streptococcus mutans, Escherichia coli, dan Candida albicans Dalam pengujian ekstrak etanol sampel, digunakan kertas cakram kosong Oxoid, Inggris dengan diameter 6 mm. Cakram dimasukkan ke dalam cawan petri kosong steril. Larutan ekstrak yang telah diencerkan dengan konsentrasi 5 , 10, 15, 20, 25 dalam larutan DMSO. Kemudian digunakan pembanding, yaitu kontrol positif pada bakteri digunakan cakram kloramfenikol dan pada jamur digunakan ketokonazol. Sebanyak 10 μl diteteskan pada permukaan cakram dan ditunggu selama 1 jam hingga larutan berdifusi ke dalam cakram. Sebanyak 10 ml media sabouraud dextrose agar SDA dan Muller Hinton Agar MHA dituangkan ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan memadat. Cotton bud steril dicelupkan pada suspensi mikroba uji dan diusapkan secara perlahan-lahan pada permukaan media secara merata, selanjutnya dibiarkan mengering selama beberapa menit. Dengan menggunakan pipet steril, cakram yang telah ditetesi dengan konsentrasi yang berbeda diletakkan secara teratur pada permukaan media uji. Selanjutnya kultur diinkubasi pada suhu 37 o C dan diamati pada jam ke 24, 48 dan jam ke 72. Aktivitas ekstrak tumbuhan dapat dilihat dengan adanya zona hambat daerah bening di sekitar cakram. Diameter zona hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong Bawa, 2011. Lihat Lampiran 3 halaman 38. Universitas Sumatera Utara

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Ekstraksi Etanol Daun Seri Muntingia calabura Linn. Dengan Metode Maserasi