3.4 Variabel yang Diamati 3.4.1 Variabel Independen:
1. MiR-21 di jaringan kanker payudara.
3.4.2 Variabel Dependen:
1. Grade histopatologis jaringan kanker payudara.
3.5 Definisi Operasional
Tabel 3.1. Definisi Operasional Penelitian
Variabel Definisi
Cara Ukur Alat Ukur
Skala Ukur
Hasil Ukur
miR-21 di
jaringan kanker
payudara noncoding-RNA
pendek, berada di
kromosom 17q23.2,
yang dijumpai
di jaringan
payudara. Isolasi
RNA, reverse
transcription RNA
menjadi cDNA,
amplifikasi menggunakan
qRT-PCR, ukur ekspresi miRNA
secara kuantitatif.
RT-qPCR Numerik
Cq
Grade histopatologis
jaringan kanker
payudara Penilaian derajat
diferensiasi jaringan kanker
Berdasarkan data rekam
medis penderita
Mikroskop Kategori Ordinal
Grade I,
II, dan
III.
Universitas Sumatera Utara
Penelitian dilakukan setelah mendapat persetujuan Majelis Komite Etik Penelitian Ethical Clearance
Penentuan sampel penelitian secara purposive sampling n = 51
Pengumpulan data melalui pencatatan data subjek penelitian, hasil pemeriksaan penunjang, serta data lainnya yang diperlukan dari rekam medik.
Isolasi RNA total dari sampel FFPE
Sintesis cDNA dari RNA hasil isolasi
Analisis miR-21 menggunakan qRT-PCR
Analisis data selanjutnya dilakukan dengan menggunakan Biorad CFX Manager TM Software yang disediakan oleh alat Real-Time qPCR untuk
mendapatkan nilai Cq. Spektrofotometri
3.6 Kerangka Operasional
Gambar 3.1. Kerangka Operasional
3.7 Alat dan Bahan Penelitian 3.7.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikrotom, vortex, mesin sentrifuga, pipet otomatis, waterbath, kuvet RNA, spektrofotometri, wadah tabung
dengan alas icepack, spindown, Thermal Cycler Biorad C1000, lemari pendingin suhu -20
C atau -80 C, dan alat qRT-PCR Biorad CFX 96.
Universitas Sumatera Utara
3.7.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah blok parafin FFPE jaringan kanker payudara hasil operasi mastektomi, tabung sentrifuga 1,5 mL, xylene,
tips filter, ethanol 96-100, buffer RF, Proteinase K, buffer RB, spin column CR3, collection tubes 1,5 mL, DNAse I, buffer RDD, buffer RW1, buffer RW, RNAse-
free ddH
2
O, dH
2
O, 5 x reaction buffer, nuclease-free water, spike in sintetik UniSp6, mixed enzyme, alumunium foil, PCR tube, SYBR Green master mix, primer
hsa-miR-21, primer UniSp6, qPCR tube, masker, sarung tangan, dan tissue.
3.8 Prosedur Kerja
a. Isolasi RNA Total dari Blok Parafin FFPE hasil operasi mastektomi
berdasarkan protokol Tiangen RNAprep Pure FFPE Kit: 1.
Iris blok parafin FFPE jaringan kanker payudara dengan ketebalan 7 μm
sebanyak 2-8 irisan menggunakan mikrotom, kemudian irisan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga 1,5 mL.
2. Tambahkan Xylene 1 mL, vortex selama 10 detik, kemudian sentrifuga
dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit pada suhu ruang 20-25 C.
3. Supernatan diaspirasi secara perlahan dengan pipet jangan sampai pellet
ikut teraspirasi. 4.
Tambahkan Ethanol 96-100 sebanyak 1 mL ke dalam tabung berisi pellet, vorteks, kemudian sentrifuga dengan kecepatan 12.000 rpm selama
2 menit pada suhu ruang 20-25 C.
Universitas Sumatera Utara
5. Supernatan diaspirasi secara perlahan dengan pipet jangan sampai pellet
ikut teraspirasi. 6.
Biarkan tutup tabung terbuka, inkubasi pellet dalam tabung selama 10 menit pada suhu ruang sampai sisa etanol menguap seluruhnya.
7. Tambahkan Buffer RF 200 μL dan Proteinase K 10 μL ke dalam tabung
berisi pellet, kemudian vortex. 8.
Inkubasi tabung dalam waterbath pada suhu 55 C selama 15 menit,
kemudian pada suhu 80 C selama 15 menit.
9. Sentrifuga dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang,
kemudian supernatan dipindahkan ke tabung sentrifuga baru RNAse-free. 10.
Tambahkan Buffer RB 220 μL ke dalam tabung berisi supernatan tersebut, kemudian vortex.
11. Tambahkan Ethanol 96-100 sebanyak 660 μL, kemudian vortex.
12. Pindahkan campuran tersebut sebanyak 700 μL ke dalam Spin Column
CR3 Spin Column CR3 dipasang di dalam tabung koleksi, sentrifuga selama 1 menit pada kecepatan 12.000 rpm, buang cairan yang ada dalam
tabung koleksi, kemudian pasang kembali Spin Column CR3 ke dalam tabung koleksi.
13. Ulangi
tahap 12, sampai semua campuran buffer dan presipitat dimasukkan ke dalam Spin Column, sentrifuga, buang cairan yang ada
Universitas Sumatera Utara
dalam tabung koleksi, kemudian pasang kembali Spin Column CR3 ke dalam tabung koleksi.
14. Siapkan larutan kerja DNAse I dengan cara masukkan 10 μL larutan stok
DNAse I ke dalam tabung RNAse-free centrifuge yang baru, kemudian tambahkan 70 μL Buffer RDD, campurkan perlahan.
15. Masukkan 80 μL larutan kerja DNAse I ini ke bagian tengah Spin Column
CR3, inkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. 16.
Tambahkan Buffer R→1 sebanyak 500 μL ke dalam Spin Column CR3, sentrifuga dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit, kemudian buang
cairan yang ada di dalam tabung koleksi, dan pasang kembali Spin Column CR3 ke dalam tabung koleksi.
17. Tambahkan Buffer RW sebanyak 500 μL ke dalam Spin Column CR3,
inkubasi dahulu selama 2 menit pada suhu ruang, kemudian sentrifuga selama 1 menit pada kecepatan 12.000 rpm.
18. Buang cairan di dalam tabung koleksi, dan pasang Spin Column CR3 ke
dalam tabung koleksi. 19.
Ulangi tahap 17-18. 20.
Sentrifuga selama 2 menit pada kecepatan 12.000 rpm pada suhu ruang, kemudian buang cairan di dalam tabung koleksi. Biarkan tutup tabung
terbuka, dan tempatkan Spin Column CR3 pada suhu ruang selama
Universitas Sumatera Utara
beberapa menit untuk mengeringkan membran, sampai membran benar- benar kering.
21. Tempatkan Spin Column CR3 ke dalam tabung sentrifuga 1,5 mL yang
baru, kemudian tambahkan 50 μL RNAse-free ddH
2
O ke bagian tengah membran. Tutup tabung, inkubasi pada suhu ruang selama 2 menit,
kemudian sentrifuga dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit sehingga diperoleh RNA Total.
22. Buang Spin Column CR3.
23. Tutup tabung sentrifuga 1,5 mL yang berisi RNA Total, dan simpan dalam
lemari pendingin suhu -80 .
b. Spektrofotometri
1. Masukkan dH
2
O sebanyak 100 μL ke dalam kuvet RNA untuk membersihkan kuvet.
2. Pilih mode RNA, kalibrasi alat dengan memasukkan kuvet RNA berisi
dH
2
O, tekan “Set Ref”. 3.
Tunggu hingga bunyi pertama, masukkan kuvet. 4.
Tunggu hingga bunyi kedua, keluarkan kuvet. 5.
Lihat hasil kalibrasi pada layar 260 nm, 0,000 AU. 6.
Keluarkan dH
2
O dari kuvet RNA hingga bersih.
Universitas Sumatera Utara
7. Ambil tabung baru sentrifuga 1,5 mL, masukkan dH
2
O sebanyak 98 μL, dan tambahkan sampel RNA
sebanyak 2 μL. 8.
Masukkan campuran tersebut sebanyak 100 μL ke dalam kuvet RNA. 9.
Masukkan kuvet RNA tersebut, tekan “Sample”.
10. Tunggu bunyi pertama, masukkan kuvet.
11. Tunggu hingga bunyi kedua, keluarkan kuvet.
12. Untuk menilai absorbansi, tekan “abs”.
13. Untuk menilai rasio, tekan “ratio”.
14. Untuk menilai konsentrasi RNA dari sampel, tekan “Conc”.
15. Keluarkan sampel dari kuvet RNA hingga bersih.
16. Lakukan kalibrasi alat dengan memasukkan dH
2
O sebanyak 100 μL ke dalam kuvet RNA
, tekan “Set Ref”. 17.
Tunggu bunyi pertama, masukkan kuvet. 18.
Tunggu hingga bunyi kedua, keluarkan kuvet. 19.
Matikan alat.
c. Sintesis cDNA dari RNA hasil isolasi dengan RT-PCR menggunakan Kit
Sintesis cDNA dari miRCURY LNA
TM
Universal RT microRNA PCR: 1.
Keluarkan RNA hasil isolasi dari lemari pendingin. 2.
Letakkan pada wadah tabung yang dialasi icepack.
Universitas Sumatera Utara
3. Biarkan mencair secara perlahan, kemudian homogenisasi dengan vortex
dan spindown. 4.
Ambil 5x Reaction Buffer, Nuclease-free water, dan Spike in UniSp6, sebagai kontrol internal terhadap miRNA yang menjadi target dari lemari
pendingin suhu -20 C.
5. Cairkan 5x Reaction Buffer, Nuclease-free water, dan Spike in UniSp6
pada suhu ruang. 6.
Homogenisasi dengan vortex, kemudian spindown. 7.
Letakkan dalam wadah tabung yang dialasi icepack. 8.
Ambil enzyme mix dari lemari pendingin suhu -20 C, homogenisasi
dengan ketuk tabungnya secara perlahan, kemudian spindown. 9.
Pembuatan dan pembagian Master Mix dilakukan dengan mencampur bahan-bahan seperti tabel di bawah:
Bahan Volume μL
5x Reaction Buffer 2
Nuclease-free water 4,5
Spike in UniSp6 0,5
Enzyme mix 1
Total 8
10. Homogenisasi Master Mix dengan vortex, kemudian spindown.
Universitas Sumatera Utara
11. Masukkan Master Mix ke dalam tabung PCR sebanyak 8 μL per reaksi.
12. Masukkan sampel RNA sebanyak 2 μL ke dalam tabung PCR yang berisi
Master Mix, kemudian spindown. 13.
Masukkan tabung tersebut ke dalam Thermal Cycler Biorad C1000, dan jalankan sesuai program:
Suhu Waktu
42 C
60 menit 95
C 5 menit
4 C
~
14. Hasil sintesis cDNA disimpan dalam lemari pendingin suhu -80
C.
d. Analisis miR-21 dengan qRT-PCR
Analisis miR-21 dilakukan dengan menggunakan alat real time-PCR dan kit miRCURY LNA
TM
Universal RT microRNA PCR, LNA
TM
PCR primers set dan SYBR Green master mix. Digunakan primer miR-21 hsa-miR-21, dan
primer UniSp6 sebagai kontrol internal terhadap miR-target. 1.
Keluarkan cDNA dari lemari pendingin. 2.
Letakkan pada wadah tabung yang dialasi icepack. 3.
Biarkan mencair perlahan. 4.
Homogenisasi dengan vortex, kemudian spindown.
Universitas Sumatera Utara
5. Encerkan cDNA dengan RNAse-free water
yaitu 5 μL cDNA dengan 395 μL RNAse-free water di dalam tabung sentrifuga 1,5 mL.
6. Homogenisasi dengan vortex kemudian spindown.
7. Letakkan tabung dalam wadah yang dialasi icepack.
8. Ambil SYBR Green Master Mix, Primer set miR-21, dan Primer Spike in
Sp6 dari lemari pendingin suhu -20 C.
9. Homogenisasi SYBR Green dengan mengetuk tabungnya perlahan tabung
SYBR Green harus tetap dialasi dengan aluminium foil, dan tidak boleh terpapar lama dengan sinar matahari.
10. Homogenisasi primer miR-21 dan primer Spike in Sp6 dengan Thawing,
vortex, kemudian spindown. 11.
Buat campuran Master Mix untuk hsa-miR-21 dan kontrol Spike in Sp6. 12.
Campurkan 5 μL SYBR Green Master Mix dengan 1 μL PCR Primer Mix untuk 1 reaksi, dan untuk masing-masing campuran dibedakan.
13. Homogenisasi dengan vortex dan spindown.
14. Masukkan campuran tersebut ke dalam masing-masing tabung qPCR
sebanyak 6 μL. 15.
Tambahkan sampel cDNA sebanyak 4 μL ke dalam tabung qPCR yang telah diisi campuran 6 μL.
Universitas Sumatera Utara
Denaturasi 95 C, 10 menit
Amplifikasi 40 siklus 95
C, 10 detik 60
C, 1 menit Ramp. Rate 1,6 Cs
Optical Read Analisis kurva leleh pilih
“Ya” 16.
Tutup tabung qPCR, beri identitas pada tabung, kemudian masukkan tabung qPCR ke dalam alat Biorad CFX 96, atur program Real-Time
qPCR sebagai berikut:
Gambar 3.2. Tahapan Siklus Real Time qPCR
Universitas Sumatera Utara
3.9 Jadwal Penelitian
Kategori