3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh
ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100 dan campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen
lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan
0,5390 g ekstrak pekat kloroform ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv secara
perlahan – lahan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan
menambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40 vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ±10 ml lalu di
KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk kristal.
3.3.5 Pemurnian
Kristal yang diperoleh dilarutkan kembali dengan Me-OH lalu dianalisis KLT untuk mencari fasa gerak yang sesuai untuk preparatif KLT. Kristal yang telah dilarutkan
ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat kaca. Plat kemudian dimasukkan kedalam bejana yang telah berisi pelarut CHCl
3
: Me-OH dengan perbandingan 90:10 vv. Kemudin ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan
dari bejana dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Setiap zona diberi tanda kemudian dikeruk lalu dielusi dengan metanol 100 dan disaring. Hasil elusi
diuapkan dan diperoleh kristal.
Universitas Sumatera Utara
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksan : etil asetat 70:30 vv. Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu
dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi. Setelah pelarut
merembes, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan kemudian difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5 hasil menunjukkan adanya bercak hitam yang menandakan adanya flavonoida.
3.3.7 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat spketrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Penelitian Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan. Menggunakan metanol
sebagai pelarut.
3.3.7.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
3.3.7.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H- NMR
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia-LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpon, Tangerang dengan
menggunakan aseton sebagai pelarut.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Skrining Fitokimia