3.2 Bahan-bahan
1. Kulit buah rambutan 2. Metanol
Teknis 3. N-heksana
Teknis 4. Etil asetat
Teknis 5. Aquadest
6. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM
E.Merck. KGaA 7. FeCl
3
5 8. NaOH 10
9. Mg-HCl 10. H
2
SO
4p
11. HCl 2 N 12. Kloroform
Teknis 13. Kapas
14. Plat KLT silika gel 60 F
254
E.Merck.Art 554 15. Plat KLT Preparatif 60 F
254
16. Benzena p.a. E. Merck
17. Eter p.a. E. Merck
18. Pereaksi Benedict
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel Sampel yang diteliti adalah kulit buah rambutan yang diperoleh dari daerah Tanjung
Anom, Medan, Sumatera Utara. Kulit buah rambutan yang masih segar dihaluskan terlebih dahulu kemudian dikeringkan di udara terbuka sebanyak 950 gram.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Kulit Buah Rambutan
Serbuk kulit buah rambutan diidentifikasi dengan mengunakan cara: 1. Skrining Fitokimia
2. Analisis kromatografi lapis tipis
3.3.2.1 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada kulit buah rambutan, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut :
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk kulit buah rambutan Nephellium lappaeum L. yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil dimasukkan ke dalam
Erlenmeyer. - Ditambahkan metanol ± 100 ml
- Didiamkan - Disaring
- Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi
a. Tabung I : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam. b. Tabung II
: dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan orange kekuningan. c. Tabung III
: dengan Mg-HCl menghasilkan larutan merah muda. d. Tabung IV
: dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet.
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT
Analisa kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai untuk komatografi kolom. Fasa gerak yang
digunakanadalah campuran n-neksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.
Universitas Sumatera Utara
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak n- heksana : eti asetat 90:10vv ke dalam bejana kromatografi kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat kloroform
pada plat KLT yang telah diaktifkan. Kemudian dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut setelah dijenuhkan lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah
dielusi dikeluarkan dari bejana lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl
3
5 . Diamati warna bercak yang ditimbul kemudian dihitung harga Rf yang diperoleh.
Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40 vv.
Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam kulit buah rambutan terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahannya diberikan pada fasa gerak
n-heksana : etil asetat 70:30 vv Lampiran 3.
3.3.3 Ekstraksi Kulit Buah Rambutan
Serbuk kulit buah rambutan ditimbang sebanyak 950 gram kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 4 liter sampai semua sampel terendam dan didiamkan ±
24 jam. Maserat ditampung dan dipekatkan menggunakan alat evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol
menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan ekstrak metanol dengan etil asetat kemudian disaring. Filtrat etil asetat kemudian dirotarievaporator
lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Dilarutkan kembali dengan metanol kemudian diekstraksi partisi dengan n-heksan secara berulang-ulang.
Dipisahkan lapisan metanol dari lapisan n-heksan lalu dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol.
Ekstrak pekat lapisan metanol dihidrolisa dengan HCl 2 N. Kemudian disaring, filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan dengan kloroform secara berulang-ulang.
Lapisan kloroform dipisahkan kemudian diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 0,5390 gram.
Universitas Sumatera Utara
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh
ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100 dan campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen
lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan
0,5390 g ekstrak pekat kloroform ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv secara
perlahan – lahan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan
menambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40 vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ±10 ml lalu di
KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk kristal.
3.3.5 Pemurnian
Kristal yang diperoleh dilarutkan kembali dengan Me-OH lalu dianalisis KLT untuk mencari fasa gerak yang sesuai untuk preparatif KLT. Kristal yang telah dilarutkan
ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat kaca. Plat kemudian dimasukkan kedalam bejana yang telah berisi pelarut CHCl
3
: Me-OH dengan perbandingan 90:10 vv. Kemudin ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan
dari bejana dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Setiap zona diberi tanda kemudian dikeruk lalu dielusi dengan metanol 100 dan disaring. Hasil elusi
diuapkan dan diperoleh kristal.
Universitas Sumatera Utara
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksan : etil asetat 70:30 vv. Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu
dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi. Setelah pelarut
merembes, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan kemudian difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5 hasil menunjukkan adanya bercak hitam yang menandakan adanya flavonoida.
3.3.7 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat spketrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Penelitian Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan. Menggunakan metanol
sebagai pelarut.
3.3.7.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
3.3.7.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H- NMR
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia-LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpon, Tangerang dengan
menggunakan aseton sebagai pelarut.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
Serbuk kulit buah rambutan Nephellim lappacem L. Dimaserasi dengan metanol
Disaring Dipekatkan
Dibagi kedalam 4 tabung reaksi
Tabung I Ditambahkan
pereaksi FeCl
3
5 Diamati perubahan
warna Terbentuk
larutan hitam hasil positif
Tabung II Tabung III
Tabung IV Ditambahkan pereaksi
NaOH 10 Diamati perubahan
warna
Tidak terbentuk Larutan biru violet
hasil negatif Tidak terbentuk
Larutan merah muda hasil negatif
Terbentuk Larutan orange kekuningan
hasil positif Ditambahkan pereaksi
H
2
SO
4p
Diamati perubahan warna
Ditambahkan pereaksi Mg-HCl
Diamati perubahan warna
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan penelitian
Serbuk kulit buah rambutan Nephellim lappacem L.
Diskrining fitokimia Dimaserasi dengan metanol sebanyak 4 L
Didiamkan selama ± 24 jam Dilakukan sebanyak 3 kali
Ekstrak metanol Residu
Diskrining fitokima Dipekatkan dengan rotarievaporator
Diuapkan hingga semua metanol menguap
Ekstrak pekat metanol Dilarutkan dengan etil asetat
Disaring
Ekstrak etil asetat Diskrining fitokimia
Dipekatkan dengan rotarievaporator Diuapkan hingga semua etil asetat menguap
Dilarutkan dengan metanol Diekstraksi partisi dengan n-heksan sampai bening
Residu tidak dilanjutkan
Lapisan metanol Diskrining fitokimia
Dipekatkan dengan rotarievaporator Diuapkan hingga pekat
Dilakukan uji kandungan gula dengan peraksi benedict + Dihidrolisis dengan HCl 2 N sambil dipanaskan selama 60 menit
Didinginkan Disaring
Lapisan n-heksan
Ekstrak metanol asam Residu
tidak dilanjutkan Diekstraksi partisi dengan kloroform sebanyak 4 kali
Lapisan kloroform Lapisan metanol asam
Universitas Sumatera Utara
Lanjutan
Lapisan kloroform Dipekatkan dengan rotarievaporator
Fraksi 1-43 90:10 Diskrining fitokmia
Diuji KLT dengan eluen n-heksan:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60;40 vv Dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak eluen n-heksan : etil asetat
90:10, 80:20, 70:30, 60;40 vv Ditampung tiap fraksi sebanyak ±10 mL dalam botol vial
Diuji KLT untuk mengetahui harga Rf Digabung fraksi dengan harga Rf yang sama
Ekstrak pekat kloroform
Fraksi 44-64 80: 20 Fraksi 65-165 70:30
Fraksi 165-182 60:40 Diuji FeCl
3
5 Hasil positif
Diuji FeCl
3
5 Hasil positif
Diuji FeCl
3
5 Hasil positif
Diuji FeCl
3
5 Hasil positif
Dianalisa KLT Dipreparatif dengan eluen kloroform: metanol 90:10 vv
Dikeringkan Digerus dari plat
Dilarutkan dengan metanol Disaring
Senyawa murni Diuapkan
Dianalisa KLT Diukur titik lebur
Dianalisis dengan spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer FT-IR, spektrometer
1
H-NMR Hasil analisis
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
Dari hasil skrining pendahuluan terhadap ekstrak dari kulit buah rambutan Nephellium lappaceum L.. Dengan adanya penambahan pereaksi-pereaksi warna
untuk menentukan golongan senyawa kimia yang dikandung dengan menggunakan pereaksi flavonoida ternyata sampel positif mengandung flavonoida.
Gambar 4.1 Spektrum UV-VISIBLE Senyawa Hasil Isolasi
Universitas Sumatera Utara
Hasil analisis spektrofotometer UV- Visibel pada kristal hasil isolasi dengan pelarut metanol yang memberikan panjang gelombang maksimum yang dapat dilihat
pada gambar 4.1. Dari hasil analisis spektrofotometer Ultraviolet Visible UV-Visible dengan
pelarut metanol gambar 4.1 memberikan panjang gelombang maksimum λ maks
261,00 nm dan 296,00 nm. Hasil analisis spektrofotometer FT-IR dari kristal hasil isolasi menghasilkan
pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang yang dapat dilihat pada gambar 4.2 dengan penjelasan sebagai berikut:
Gambar 4.2. Spektrum Inframerah FT-IR Senyawa Hasil Isolasi
Universitas Sumatera Utara
Hasil analisis Spektrofotometer FT-IR pada kristal hasil isolasi menghasilkan pita–pita serapan pada daerah bilangan gelombang yang ditunjukkan pada Tabel 4.1
berikut: Pavia, 1979
Tabel 4.1 Serapan pada analisis Spektrofotometer FT-IR No
Bilangan gelombang cm
-1
Jenis Ikatan Frekuensi
1 3462,22 – 3404,36
-OH Tajam
2 2956,87 – 2854,65
C-H alifatis
Tajam
3 1689,64
C=O keton
Tajam
4 1608,63
C=C aromatik
Tajam 5
1342,46 CH3
Sedang 6
1238,30 C-O
alkohol Tajam
7 1124,50
C-O-C tak simetris
Tajam
Universitas Sumatera Utara
Hasil analisis spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton H-NMR senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut aseton
dan TMS sebagai standar yang memberikan signal-signal pergeseran kimia pada daerah yang dapat dilihat pada
gambar 4.3.
Gambar 4.3. Spektrum
1
H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
H-3’ H-5’
H-2 H-2’
H-6’
Universitas Sumatera Utara
Hasil analisis Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut aseton dan TMS
sebagai standar memberikan pergeseran kimia ppm yang ditunjukkan pada Tabel 4.2 berikut:
Tabel 4.2 Pergeseran kimia pada analisa spektometer
1
H-NMR
No Pergeseran kimia δ
ppm Bentuk Puncak
Keterangan
1 3,7981
Singlet Menunjukkan proton dari fungsi
metoksi
2 6,8826-6,8995
Doublet Menunjukkan proton H-3’ dan
H-5’ pada cincin B struktur flavonoida
3 7,4248-7,4417
Doublet Menunjukkan proton H-2’ dan
H-6’ pada cincin B struktur flavonoida
4 7,4871
Singlet Menunjukkan proton H-2 pada
cincin C struktur flavonoida
Universitas Sumatera Utara
4.2 Pembahasan
Kategori