III. BAHAN DAN METODE
3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan September 2009 sampai Mei 2010. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yakni: Tahap isolasi, seleksi,
pembuatan inokulum, dan analisis sifat kimia dilakukan di Laboratorium Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, Institut
Pertanian Bogor. Penanaman untuk menguji inokulum dilakukan di Laboratorium Pengembangan dan Sumberdaya Fisik Lahan, Departemen Ilmu Tanah dan
Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah inokulum bakteri rhizobia yang dibuat dari bintil akar tanaman A. mangium yang berasal dari tiga
lokasi berbeda lihat bab 3.3.1, benih tanaman A. mangium, kotoran sapi, dan tanah yang digunakan sebagai media tanam merupakan tanah yang berasal dari
tanah sisa tambang. Alat yang digunakan antara lain bunsen, jarum oose, shaker, laminar flow, inkubator, autoklaf, polybag berukuran 15 cm x 20 cm, dan
saringanayakan tanah.
3.3. Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap yaitu: pengambilan sampel bintil akar di lapang, proses pembuatan inokulum, persiapan media tanam,
penanaman, aplikasi pupuk urea dan KH
2
PO
4
, pengamatan, analisis jaringan tanaman dan tanah seperti yang terlihat pada Gambar 1. Parameter yang diamati
pada penelitian ini adalah tinggi tanaman yang diukur tiap minggu. Dari pengamatan ini akan diketahui pertumbuhan vegetatif tanaman.
3.3.1. Pengambilan bintil akar
Pengambilan bintil akar dilakukan di tiga lokasi yaitu PT. Kaltim Prima Coal, Sanggata, Kalimantan Timur yang diberi notasi KPC; Daerah transmigrasi
Rantau Rasau, Jambi yang diberi notasi RR; dan lahan di belakang Laboratorium
Gambar 1. Tahapan Pelaksanaan Penelitian
Penanaman Bibit Acacia mangium
Sterilisasi dan Isolasi Rhizobia dari bintil Pemurnianperemajaan Isolat Rhizobia di
cawan petri Uji ketahanan Rhizobia
dalam media YEMA
Pembuatan Stock Culture
Isolat diperbanyak dan disimpan dalam bentuk agar miring yang disimpan di
lemari es pada suhu 4 C
Pembuatan Inokulum Cair Inokulum cair dibuat dengan
menumbuhkan Rhizobia pada media YEM sebanyak 50 ml kemudian diinkubasi
selama 3-5 hari
Aplikasi inokulum ke A. mangium 2MST
Pengambilan Contoh Bintil Akar
Persiapan Media Tanam
Tanah masam bekas tambang campur Kotoran Sapi 1:1
Pengaplikasian Pupuk
Urea 0.12 gpolybag, KH
2
PO
4
0.08 gpolybag
Pengamatan
Tinggi tanaman dan Bobot kering
Analisis
Jaringan Tanaman dan Tanah N-Total,
Amonium dan Nitrat Seleksi Inokulum cair
dengan menggunakan haemacytometer
Pengembangan dan Sumberdaya Fisik Lahan IPB, Kabupaten Bogor yang diberi
notasi KAMPUS. 3.3.2.
Pembuatan Inokulum
Setelah sampel diambil dari lapang dilakukan sterilisasi permukaan bintil akar kemudian bintil akar diisolasi dengan cara ditumbuhkan pada media YEMA
Yeast Extract Manitol Agar. Isolat tersebut kemudian dimurnikan atau dilakukan peremajaan hingga isolat bebas dari kontaminan. Setelah diperoleh isolat yang
bebas dari kontaminan dan memiliki penampakan fisik paling baik maka dilakukan pembuatan stock culture di tabung reaksi. Dari stock culture tersebut
dibuat inokulum cair pada media YEM Yeast Extract Manitol sebanyak 50 ml yang diinkubasi selama 3-5 hari. Untuk memperoleh jumlah populasi yang
diinginkan yakni 10
9
sel ml
-1
, maka dilakukan seleksi inokulum cair dengan menggunakan haemacytometer. Hasil dari seleksi inilah yang nantinya
diaplikasikan ke bibit A. mangium yang berumur 2 MST.
3.3.3. Persiapan Media Tanam
Pembuatan media tanam dilakukan dengan mencampurkan tanah bekas sisa tambang dengan kotoran sapi dengan perbandingan 1:1 dan pH dari media tanam
ini sebesar 3.68. Setelah dicampur media tanam tadi kemudian disterilisasi dengan autoklaf sebanyak dua kali dengan selang waktu 24 jam pada suhu 121
C selama 20 menit dengan tekanan 0.1 MPa. Sterilisasi sebanyak dua kali dilakukan agar
semua total mikrob dan fungi yang menjadi penghambat pertumbuhan Rhizobium dapat dihilangkan.
3.3.4. Penanaman, Pengaplikasian Pupuk dan Inokulasi
Penanaman ke dalam polybag dilakukan setelah bibit berumur dua minggu dan dua hari kemudian dilakukan pengaplikasian pupuk. Untuk pengaplikasian
pupuk diberikan urea 0.12 gpolybag 50 ppm N atau setara dengan 240 kgha urea dan KH
2
PO
4
0.08 gpolybag 20 ppm P atau setara dengan 160 kgha KH
2
PO
4
, dengan asumsi bobot isi tanah 1 gcm
3
. Pemberian inokulum rhizobia
diberikan sebanyak 1 ml yaitu 10
9
sel ml
-1
, dengan cara menyiramkan inokulum tersebut pada setiap pangkal batang untuk masing-masing perlakuan tiap polybag.
3.3.5. Perawatan dan Pengamatan
Penyiraman dilakukan setiap hari pagi dan sore dengan menggunakan aquades. Setiap Minggu Setelah Tanam MST dilakukan pengukuran tinggi
tanaman sampai tanaman berumur 10 MST.
3.3.6. Analisis Jaringan Tanaman dan Tanah
Analisis jaringan tanaman dilakukan setelah tanaman berumur 10 MST meliputi Bobot Kering Tanaman, Kadar dan serapan N. Untuk mendapat kadar
dan serapan N tanaman, jaringan tanaman bagian atas digiling terlebih dahulu. Penetapan N total tanaman dengan metode mikro Kjedahl.
Analisis tanah meliputi analisis amonium dan nitrat yang penetapannya menggunakan makro Kjedahl.
3.4. Rancangan Penelitian
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap. Penelitian ini terdiri dari 4 perlakuan individual masing-masing diulang
sebanyak sepuluh kali sehingga terdapat 40 satuan percobaan. Setiap perlakuan merupakan pemberian inokulum rhizobia sebanyak 1 ml setiap polybag yang
berisi tanah sebanyak 500 gram BKM. Inokulum yang diberikan berasal dari tiga lokasi yang berbeda, yaitu Rantau Rasau, Jambi dan PT. KPC Kaltim Prima
Coal, Kalimantan Timur serta halaman Laboratorium Pengembangan
Sumberdaya Fisik Lahan, Bogor yang masing-masing memiliki pH tanah rendah.
Model pendekatan statistika yang digunakan :
Ket : Yij = pengaruh perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = rataan
αi = pengaruh perlakuan ke-i εij = pengaruh galat percobaan pada ulangan ke-j dengan perlakuan ke-i
Yij = µ + αi + εij
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Karakteristik Isolat Rhizobia
Isolat Rhizobia diambil dari bintil akar A. mangium mempunyai pH tanah yang rendah yakni Rantau Rasau RR dengan pH tanah 2.0-3.0; PT. Kaltim
Prima Coal KPC dengan pH tanah 3.5-4.0; dan lahan di belakang Laboratorium Pengembangan Sumberdaya Fisik Lahan KAMPUS dengan pH sekitar 5.0.
Semua isolat rhizobia setelah ditumbuhkan pada media YEMA Yeast Extract Mannitol Agar akan menunjukkan karakteristik sebagai berikut: 1.
Berbentuk bundar, 2. Tampak berkilau dan licin, 3. Permukaan berlendir dengan elevasi cembung, 4. Berwarna putih atau putih susu. Tetapi kecepatan
pertumbuhan tiap isolat berbeda-beda, hal ini terlihat dari waktu kecepatan tumbuh yang berbeda pada isolat rhizobia yang berasal dari Rantau Rasau, di
mana isolat tersebut kurang mampu bertahan lebih lama dibandingkan dengan isolat yang lain. Hal ini disebabkan metabolisme rhizobia tersebut berbeda dengan
metabolisme rhizobia lainnya, di mana rhizobia ini memiliki respirasi yang tinggi sehingga membutuhkan makanan yang lebih banyak. Ketersediaan cadangan
makanan pada media YEMA yang digunakan untuk menumbuhkan rhizobia belum tentu dapat memenuhi kebutuhan rhizobia sehingga media cepat habis dan
menjadi kering Gambar 2 dan Tabel 1.
Gambar 2. Isolat Rhizobia pada Cawan Petri
Kategori