b. Amplifikasi DNA
Komponen PCR yang digunakan per reaksi volume 10 µL untuk analisis SSR adalah 2 µL DNA; 0,12 µL Taq-polymerase; 1 µL 5 mM primer SSR;
0,2 µL 10 mM dNTPs; 1µL 10
Buffer PCR; dan 5,68 µL ddH
2
O. Amplifikasi fragmen DNA dilakukan dengan reaksi berantai polimerase
PCR yang bertujuan untuk menggandakan sekuen DNA berdasarkan primer yang digunakan. Profil PCR yang digunakan adalah pre-denaturasi
94°C selama 5 menit, denaturasi 94°C selama 30 detik, penempelan primer 65°C selama 30 detik, pemanjangan primer 72°C selama 30 detik. Proses
tersebut diulang sebanyak 30 siklus.
c. Elektroforesis gel
Hasil amplifikasi kemudian dielektroforesis menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida PAGE yang terbuat dari 500 mL akrilamid 8, 500 µL
APS 10, dan 50 µL Temed yang dituangkan ke kaca. Ketebalan gel ini antara 0,75
–1,5 mm. PAGE dimasukkan kedalam tangki elektroforesis yang berisi lartan penyangga TBE 1 kali pH 8. Sebanyak 10 µL produk PCR
ditambahkan dengan 3 µL loading dye dan dicampur sempurna, kemudian dimasukkan 2 µL campuran ke dalam sumur gel. Disertakan 2 µL penanda
ukuran untuk melihat ukuran DNA. Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus listrik dengan tegangan 80 volt selama 90-100 menit.
d. Dokumentasi hasil elektroforesis gel
PAGE diwarnai dengan larutan etidium bromida 20 mgL selama 10 menit. Selanjutnya dihilangkan pewarnaanya dengan air selama 10 menit.
Gel pita-pita DNA selanjutnya di foto dengan chemidoc gel system. Hasil visualisasi ini kemudian diskoring dengan A merupakan pita yang sama
dengan pita Ciherang, B merupakan pita yang sama dengan B11143D, dan H heterozigot merupakan pita yang sama dengan Ciherang dan B11143D.
Gambar 3. Contoh skoring pengamatan molekuler menggunakan penanda SSR padi.
3.2.4 Analisis Data dan Kriteria Seleksi
Evaluasi fenotipe dilakukan pada setiap karakter agronomi populasi BC
3
F
2
dan tetua menggunakan perangkat lunak Statistical tool for agricultural research 2.1 STAR. Analisis korelasi juga dilakukan terhadap karakter-karakter agronomi
yang bertujuan untuk mendapatkan informasi adatidaknya hubungan dan arah hubungan positifnegatif dari karakter agronomi terhadap hasil dan atau
C ihe
rang B
1114 3D
M H H H H A B H H A A H
komponen hasil. Perhitungan koefisien korelasi dan pengujian pengaruh setiap karakter terhadap hasil dan komponen hasil dihitung dengan membandingkan
nilai t
hitung
dengan t
tabel
pada taraf α = 0.05, α = 0.01, dan α = 0.001.
Hasil pengamatan molekuler populasi BC
3
F
2
menggunakan 4 penanda SSR kromosom 12 kemudian diskoring dengan ketentuan A Homozigot Ciherang, H
Heterozigot, dan B Homozigot B11143D Gambar 3. Identifikasi keterkaitan penanda dan karakter morfologi terkait potensi hasil akan dilakukan dengan
pengujian Regresi Penanda Tunggal Single Marker Regression menggunakan perangkat lunak Qgene Ver. 4.3.8 Joehanes dan Nelson 2008. Parameter yang
ditetapkan untuk pemetaan QTL adalah struktur populasi BC
3
F
2
. Permutasi dari 10.000 iterasi digunakan untuk menentukan ambang nilai QTL di QGene.
Selanjutnya, nilai-nilai LOD logaritma peluang pada P 0.05 digunakan sebagai ambang batas untuk menentukan arti dari QTL. Sebuah QTL dianggap valid atau
diyakini keberadaannya apabila nilai LOD QTL tersebut LODpermutasi pada α = 0,05.
Sebaliknya, sebuah QTL dianggap tidak valid atau hanya sebagai sugestif apabila nilai LOD QTL LOD
permutasi pada α = 0,05. Nilai LOD = 3 berarti
1000 х lebih mungkin terdapat QTL pada daerah penanda tersebut daripada tidak
ada QTL. Dari analisis ini juga diketahui seberapa besar efek aditif untuk sifat komponen hasil tertentu populasi BC
3
F
2
jika alel Ciherang A diganti dengan alel galur PTB B pada daerah keempat penanda SSR yang digunakan. Pemetaan
penanda-penanda SSR untuk seleksi foreground dan seleksi background pada beberapa individu terpilih populasi BC
3
F
2
didapatkan dari hasil kuantifikasi visualisasi pola pita DNA yang diolah dengan perangkat lunak grapichal
genotypes 2.0 GGT. Hasil visualisasi ini digunakan untuk membuat peta introgresi segmen kromosom tetua donor B11143D pada latar genetik Ciherang.
Berdasarkan hasil analisis dan pemetaan penanda kemudian dilakukan pemilihan individu-individu pada populasi BC
3
F
2
untuk diteruskan sebagai bahan penelitian selanjutnya. Individu-Individu terpilih yang diteruskan ke populasi
BC
3
F
3
adalah individu-individu yang genotipenya sudah kembali ke Ciherang kelompok A untuk daerah penanda yang tidak terindikasi adanya QTL terkait
sifat komponen hasil tertentu namun masih dalam keadaan heterozigot kelompok H untuk daerah penanda yang terindikasi adanya QTL komponen hasil tertentu.
3.3 Hasil dan Pembahasan 3.3.1 Evaluasi Fenotipe
Pengamatan fenotipe phenotyping dilakukan terhadap kedua tetua Ciherang dan B11143D dan 200 individu dalam populasi BC
3
F
2
hasil penyerbukan sendiri dari populasi BC
3
F
1
. Data phenotyping merupakan salah satu dasar dalam menentukan daerah identifikasi QTL terkait sifat tertentu.
Kegiatan ini dilaksanakan di rumah kaca dari tanaman mulai keluar malai sampai pasca panen.
Galur tetua donor B11143D menunjukkan karakteristik dari padi tipe baru yaitu jumlah malai sedikit, jumlah gabah per malai yang tinggi, bobot 1000 butir
yang tinggi, dan postur tanaman yang lebih besar jika dibandingkan dengan tetua berulang Ciherang Tabel 1. B11143D berbunga lebih awal dari Ciherang Tabel
1, Gambar 4. Rata-rata bobot total B11143D sama dengan Ciherang yaitu sebesar 25.13 g dan 23.42 g per rumpun Tabel 1.
Kategori