Identifikasi QTL Komponen Hasil

3.1 Pendahuluan

Padi merupakan tanaman pangan pokok yang dikonsumsi lebih dari setengah populasi dunia. Dibutuhkan peningkatan produksi padi minimal 40 lebih untuk memenuhi kebutuhan pangan pada tahun 2030 Wang et al. 2014. Salah satu solusi yang dapat mengatasi permasalahan ini adalah perakitan varietas unggul melalui peningkatan potensi hasil. Persilangan antar kultivar-kultivar unggul yang telah dirilis dan sumber material genetik baru terus dilakukan untuk menjaga agar perbaikan hasil selalu terjaga. Padi Ciherang merupakan salah satu kultivar unggul Indonesia dan dibudidayakan pada lebih dari 40 luas area produksi di Indonesia sejak tahun 2007. Kultivar unggul lainnya yang mulai populer adalah Padi Tipe Baru PTB. B11143D merupakan salah satu galur padi tipe baru dengan beberapa karakter agronomi seperti umur berbunga, luas daun bendera, jumlah gabah per malai, dan bobot 1000 butir yang lebih baik dibandingkan Ciherang Susilowati et al. 2014. Sebagai sumber perbaikan sifat, padi tipe baru diharapkan dapat menyumbang sifat komponen hasil yang lebih tinggi dibandingkan Ciherang. Oleh karena itu galur-galur turunan dari Ciherang dan padi tipe baru melalui silang balik diharapkan memiliki potensi hasil yang lebih tinggi dari kedua padi unggul ini sehingga terjadi perbaikan sifat kultivar unggul. Populasi galur introgresi merupakan salah satu cara untuk memperoleh galur-galur tersebut. Populasi galur introgresi adalah populasi yang terdiri dari galur-galur yang masing-masing membawa segmen kromosom tertentu dengan latar belakang genetik yang sama. Populasi galur introgresi sangat penting dalam mempelajari fungsi genetik dari segmen-segmen kromosom yang tersubtitusi untuk kegiatan pemetaan gen. Ebitani et al. 2005 menyatakan bahwa populasi galur introgresi dapat digunakan dalam analisis genetik untuk mengasosiasikan Quantitative Trait Loci QTL dengan daerah kromosom tertentu dan dengan cepat mengembangkan daerah sasaran yang mengandung QTL. Ada banyak penanda yang bisa digunakan untuk mengidentifikasi daerah QTL salah satunya adalah penanda Simple Sequence Repeats SSR. Tersedianya peta pautan genetik yang sangat padat terutama berisi penanda SSR dapat mempermudah pencarian penanda yang terpaut dengan suatu karakter sehingga mempermudah dalam identifikasi QTL target. Hasil gabah merupakan sifat yang kompleks dan ditentukan oleh tiga komponen utama yaitu jumlah malai, jumlah gabah per malai, dan bobot biji atau ukuran biji. Ketiga komponen utama ini dikendalikan oleh banyak gen Xing dan Zhang 2010. Setidaknya terdapat 18 QTL terkait jumlah malai pada padi yang berhasil diidentifikasi dari 9 kromosom padi Liu et al. 2008. Selain itu, empat QTL utama terkait jumlah gabah per malai pada kromosom 1, 4, 6, dan 7 sudah berhasil di klon atau dipetakan lebih lanjut Liu et al. 2008; Fujita et al. 2013; Balkunde et al. 2013; Kim et al. 2014. Enam belas QTL terkait bobot gabah yang tersebar pada kromosom 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 dan 11 juga sudah berhasil di klon atau dipetakan lebih lanjut Huang et al. 2012. Hasil penelitian sebelumnya menduga adanya daerah QTL komponen hasil di kromosom 12 berdasarkan hasil whole genome survey pada populasi BC 1 F 1 turunan dari persilangan Ciherang dan B11143D Widyawan, 2014. Berdasarkan penelitian ini dilakukan MAS marker assisted selection dengan seleksi foreground kromosom 12 dan seleksi background kromosom 1-11. Kegiatan MAS ini diperoleh 1 galur BC 3 F 1 yang heterozigot pada keseluruhan bagian kromosom 12, sedangkan sebagaian besar wilayah di kromosom 1-11 sudah homozigot Ciherang Rahmah 2015. Selanjutnya pada penelitian ini akan dilakukan pemetaan untuk mengidentifikasi QTL lebih lanjut terkait komponen hasil pada galur-galur yang terintrogresi segmen kromosom PTB di kromosom 12 populasi galur introgresi berbasis Ciherang. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi daerah QTL terkait karakter komponen hasil padi pada kromosom 12. 3.2 Bahan dan Metode 3.2.1 Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Biologi Molekuler dan Rumah Kaca Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian BB BIOGEN, Bogor, Jawa Barat. Waktu pelaksanaan dimulai pada bulan Juni 2015 sampai Desember 2015.

3.2.2 Bahan dan Alat

Gambar 2. Peta genetik galur terpilih yang memiliki introgresi kromosom 12 dari PTB sebagai donor dengan Ciherang sebagai background genetics Rahmah 2015. Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah galur terpilih dari populasi BC 3 F 1 turunan Ciherang х PTB B11143D yang memiliki introgresi segmen kromosom 12 dari tetua donor B11143D Gambar 2. Galur ini didapatkan dari hasil seleksi foreground dan seleksi background pada populasi BC 3 F 1 . Ciherang sebagai tetua berulang dan B11143D sebagai tetua donor. Galur terpilih dari populasi BC 3 F 1 akan ditanam sebanyak 200 tanaman dan membentuk populasi BC 3 F 2 . Galur-galur populasi BC 3 F 2 akan dievaluasi dan diidentifikasi QTL tahap awal pemetaan terarah terkait komponen hasil. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari ember, cangkul, meteran, dan grain counter, sedangkan alat-alat untuk pengamatan molekuler adalah penanda SSR polimorfik, mesin thermal cycle, elektroforesis gel poliakrilamida PAGE, dan Chemidoc Gel System.

3.2.3 Prosedur Penelitian

Pada penelitian ini populasi BC 3 F 2 diamati secara morfologi phenotyping dan secara molekuler genotyping sebagai dasar penentuan daerah QTL komponen hasil. 1. Pengamatan karakter agronomi Phenotyping Pengamatan karakter agronomi yang dilakukan meliputi umur berbunga UB, tinggi tanaman TT, panjang daun bendera PDB, jumlah malai per tanaman JMP, panjang malai PM, jumlah gabah isi per malai JGI, bobot 1000 butir BB, dan bobot total per rumpun BT. Jumlah malai, jumlah gabah per malai, dan bobot gabah merupakan tiga komponen hasil utama yang menentukan produksi hasil padi.

2. Pengamatan molekuler Genotyping

Pengamatan molekuler populasi BC 3 F 2 pada kromosom 12 digunakan sebagai dasar untuk identifikasi daerah QTL komponen hasil menggunakan penanda SSR polimorfik di kromosom 12 yaitu RM3472, RM28048, RM28195, dan RM1986. Pengamatan molekuler yang dilakukan pada wilayah heterozigot untuk membersihkan daerah di luar target menggunakan penanda SSR polimorfik pada kromosom 2 RM233, RM279, RM5897, kromosom 4 RM335, RM1359, kromosom 5 RMw513, kromosom 7 RM500, kromosom 8 RM25, RM72, RM404, RM1235, RM223, kromosom 9 RM24175, kromosom 10 RM5348, dan kromosom 11 RM332, RM202, RM254, RM5926, RM1812. Pengamatan molekuler ini dilakukan dengan tahapan isolasi DNA, amplifikasi DNA, dan elektroforesis gel. a. Isolasi DNA Isolasi DNA padi menurut Murray dan Thompson 1980 yang termodifikasi adalah daun muda padi ± 15 cm dipotong dan dimasukkan kedalam tabung mikro 1,5 mL yang sudah diberi label. Tabung mikro yang berisi sampel daun direndam dalam nitrogen cair, kemudian sampel daun digerus menggunakan pelor dan tissue lyzer hingga menjadi serbuk. Selanjutnya tambahkan 665 µL buffer ekstraksi yang terdiri dari 60 mL NaCl 5M, 50 mL Tris 1M pH 8, dan 50 mL EDTA 0,5 M dan 35 µL SDS 20. Dilakukan vortex setiap penambahan larutan. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 90 µL CTAB dan diinkubasi lagi pada suhu 65°C selama 10 menit. Setelah itu, ditambahkan 900 µL Chloroform dan dilakukan sentrifugasi dengam kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Cairan bening yang berada diatas, dipindahkan ke tabung mikro 2 mL dan ditambahkan 600 µL isopropanol dingin. Lalu didiamkan selama 20 menit pada suhu -20°C dan disentrifugasi lagi dengan kecepatan yang sama selama 5 menit serta cairan diambil dengan pipet mikro sehingga cairan tidak ada sama sekali di dalam tabung mikro. Pelet yang diperoleh dicuci dua kali dengan 500 µL ethanol 70. Pengeringan dapat dilakukan dengan suhu kamar selama 18 jam. Pelet yang telah kering dilarutkan kedalam 30µL buffer TE 1 kali dan ditambahkan 2 µL RNAse. lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Simpan DNA pada suhu - 20°C selama 1 jam. Pengenceran DNA dilakukan dengan penambahan 170 µL ddH 2 O.

b. Amplifikasi DNA

Komponen PCR yang digunakan per reaksi volume 10 µL untuk analisis SSR adalah 2 µL DNA; 0,12 µL Taq-polymerase; 1 µL 5 mM primer SSR; 0,2 µL 10 mM dNTPs; 1µL 10  Buffer PCR; dan 5,68 µL ddH 2 O. Amplifikasi fragmen DNA dilakukan dengan reaksi berantai polimerase PCR yang bertujuan untuk menggandakan sekuen DNA berdasarkan primer yang digunakan. Profil PCR yang digunakan adalah pre-denaturasi 94°C selama 5 menit, denaturasi 94°C selama 30 detik, penempelan primer 65°C selama 30 detik, pemanjangan primer 72°C selama 30 detik. Proses tersebut diulang sebanyak 30 siklus.

c. Elektroforesis gel

Hasil amplifikasi kemudian dielektroforesis menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida PAGE yang terbuat dari 500 mL akrilamid 8, 500 µL APS 10, dan 50 µL Temed yang dituangkan ke kaca. Ketebalan gel ini antara 0,75 –1,5 mm. PAGE dimasukkan kedalam tangki elektroforesis yang berisi lartan penyangga TBE 1 kali pH 8. Sebanyak 10 µL produk PCR ditambahkan dengan 3 µL loading dye dan dicampur sempurna, kemudian dimasukkan 2 µL campuran ke dalam sumur gel. Disertakan 2 µL penanda ukuran untuk melihat ukuran DNA. Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus listrik dengan tegangan 80 volt selama 90-100 menit.

d. Dokumentasi hasil elektroforesis gel

PAGE diwarnai dengan larutan etidium bromida 20 mgL selama 10 menit. Selanjutnya dihilangkan pewarnaanya dengan air selama 10 menit. Gel pita-pita DNA selanjutnya di foto dengan chemidoc gel system. Hasil visualisasi ini kemudian diskoring dengan A merupakan pita yang sama dengan pita Ciherang, B merupakan pita yang sama dengan B11143D, dan H heterozigot merupakan pita yang sama dengan Ciherang dan B11143D. Gambar 3. Contoh skoring pengamatan molekuler menggunakan penanda SSR padi.

3.2.4 Analisis Data dan Kriteria Seleksi

Evaluasi fenotipe dilakukan pada setiap karakter agronomi populasi BC 3 F 2 dan tetua menggunakan perangkat lunak Statistical tool for agricultural research 2.1 STAR. Analisis korelasi juga dilakukan terhadap karakter-karakter agronomi yang bertujuan untuk mendapatkan informasi adatidaknya hubungan dan arah hubungan positifnegatif dari karakter agronomi terhadap hasil dan atau C ihe rang B 1114 3D M H H H H A B H H A A H