kromosom 12 yang mengandung daerah QTL sifat komponen hasil tertentu. Galur terpilih dari populasi BC
3
F
2
akan ditanam sebanyak 1200 tanaman dan membentuk populasi BC
3
F
3
. Galur-galur populasi BC
3
F
3
akan diseleksi berdasarkan hasil pengamatan molekuler tahap 1. Kegiatan seleksi dilakukan
sebelum tanaman memasuki fase generatif ± 28 hss dan terdapat ± 300 tanaman terpilih. Individu-individu terpilih ini akan dilanjutkan pengamatan molekuler
tahap 2 dan tahap 3 serta pengamatan morfologi.
4.2.3 Prosedur Penelitian
Pada percobaan 2 populasi BC
3
F
3
diamati secara morfologi phenotyping dan secara molekuler genotyping sebagai dasar pemetaan halus daerah QTL
komponen hasil tertentu. Prosedur penelitian pada percobaan 2 hampir sama dengan percobaan 1 namun pada percobaan 2 ini dilakukan seleksi awal sebelum
tanaman memasuki fase generatif. 1.
Pengamatan karakter agronomi Phenotyping
Pengamatan karakter agronomi yang dilakukan meliputi umur berbunga UB, tinggi tanaman TT, panjang daun bendera PDB, jumlah malai per
tanaman JMP, panjang malai PM, jumlah gabah isi per malai JGI, bobot 1000 butir BB, dan bobot total per rumpun BT.
2. Pengamatan molekuler Genotyping
Pengamatan molekuler
kromosom 12
untuk populasi
BC
3
F
3
menggunakan penanda-penanda SSR di daerah yang terindentifikasi QTL komponen hasil dari populasi BC
3
F
2
. Pengamatan molekuler tahap 1 akan dilakukan pada 1200 tanaman menggunakan 2 penanda pengapit segmen yang
mengandung daerah QTL tertentu pada kromosom 12 hasil percobaan 1. Hasil pengamatan molekuler tahap 1 ini digunakan sebagai dasar pemilihan
300 individu terpilih yang akan dilanjutkan sampai fase panen. Pengamatan molekuler tahap 2 akan dilakukan pada 300 tanaman terpilih menggunakan
penanda-penanda SSR polimorfik di daerah segmen tersebut. Penanda-penanda SSR ini didapatkan dari hasil analisis SNP antara Ciherang dan B11143D yang
telah dilakukan di IRRI pada tahun 2015. Pengamatan molekuler tahap 1 dan tahap 2 merupakan kegiatan seleksi foreground. Identifikasi yang dilanjutkan
pada populasi BC
3
F
3
untuk memperkecil daerah QTL yang ditemukan menggunakan penanda-penanda yang lebih spesifik. Pengamatan molekuler ini
dilakukan dengan tahapan isolasi DNA, amplifikasi DNA, dan elektroforesis gel.
4.2.4 Analisis Data dan Kriteria Seleksi
Individu-individu terpilih akan dikelompokkan menjadi 3 grup, yaitu A, B, dan H untuk setiap penanda yang digunakan dalam kegiatan seleksi foreground.
Analisis statistika dilakukan untuk membandingkan rata-rata fenotipe antara A vs B vs H, dan antara A vs B menggunakan perangkat lunak Statistical tool for
agricultural research 2.1 STAR. Dari analisis ini akan diketahui seberapa besar efek aditif untuk sifat komponen hasil tertentu populasi BC
3
F
3
jika alel Ciherang A diganti dengan alel galur PTB B pada daerah setiap penanda SSR yang
digunakan di kromosom 12. Pemetaan penanda-penanda SSR untuk seleksi foreground pada beberapa individu terpilih populasi BC
3
F
3
didapatkan dari hasil
kuantifikasi visualisasi pola pita DNA yang diolah dengan perangkat lunak grapichal genotypes 2.0 GGT. Hasil visualisasi ini digunakan untuk membuat
peta introgresi segmen kromosom tetua donor B11143D pada latar genetik Ciherang. Berdasarkan hasil analisis dan pemetaan penanda maka masih
dilakukan pemilihan individu-individu pada populasi BC
3
F
3
untuk diteruskan sebagai bahan percobaan selanjutnya. Percobaan selanjutnya dapat memperhalus
pemetaan QTL yang sudah dilakukan pada percobaan 2 ini. Identifikasi keterkaitan penanda dan karakter bobot 1000 butir akan
dilakukan dengan pengujian Regresi Penanda Tunggal Single Marker Regression menggunakan perangkat lunak Qgene Ver. 4.3.8 Joehanes dan
Nelson 2008. Parameter yang ditetapkan untuk pemetaan QTL adalah struktur populasi BC
3
F
3
. Permutasi dari 10000 iterasi digunakan untuk menentukan ambang nilai QTL di QGene. Selanjutnya, nilai-nilai LOD logaritma peluang
pada P 0.05 digunakan sebagai ambang batas untuk menentukan arti dari QTL. Sebuah QTL dianggap valid atau diyakini keberadaannya apabila nilai LOD QTL
tersebut LOD permutasi pada α = 0,05.
Sebaliknya, sebuah QTL dianggap tidak valid atau hanya sebagai sugestif apabila nilai LODnya LODpermutasi pada α =
0,05. Nilai LOD = 3 berarti 1000
х lebih mungkin terdapat QTL pada daerah penanda tersebut daripada tidak ada QTL. Hasil analisis menunjukkan seberapa
besar efek aditif untuk sifat bobot 1000 butir populasi BC
3
F
3
jika alel Ciherang A diganti dengan alel galur PTB B pada daerah kelima penanda SSR yang
digunakan. Daerah yang memiliki nilai LOD tinggi dari hasil analisis ini akan dilakukan pendugaan kandidat gen dengan cara mencari daftar gen-gen yang
terletak di daerah tersebut berdasarkan Genome Browser dari database Rice Genome Annotation
http:www.rice.plantbiology.msu.edu . Selain itu juga akan
dilakukan pencarian fungsi molekuler, fungsi biologi, dan fungsi seluler gen ontologi dari daftar gen tersebut agar penentuan kandidat gen dapat dilakukan
lebih akurat.
4.3 Hasil dan Pembahasan
Populasi BC
3
F
3
terdiri dari 1200 individu tanaman yang dikembangkan dari individu terpilih populasi BC
3
F
2
. Masing-masing galur BIOR1-85-193 dan BIOR1-85-302 membentuk 600 individu pada populasi BC
3
F
3
. Kegiatan seleksi foreground pada populasi BC
3
F
3
dilakukan 2 tahap. Pertama, pengamatan molekuler 1200 individu menggunakan 2 penanda pengapit flanking marker
daerah QTL bobot 1000 butir yaitu RM28048 dan RM1986. Hasil dari kegiatan ini menjadi dasar pemilihan 300 individu terpilih yang diteruskan. Terdapat 114
individu terpilih dari galur BIOR1-85-193 dan 186 individu terpilih dari galur BIOR1-85-302.
Kedua, pengamatan
molekuler 300
individu terpilih
menggunakan 4 marka tambahan yang berada di antara dan disekitar RM28048 dan RM1986 Tabel 5.
Hasil pengamatan seleksi foreground tahap 1 membagi individu-individu populasi ini menjadi 9 kelompok yaitu kelompok 1 RM28048 A dan RM1986
B; kelompok 2 RM28048 A dan RM1986 H; kelompok 3 RM28048 A dan RM1986 A; kelompok 4 RM28048 H dan RM1986 B; kelompok 5
RM28048 H dan RM1986 H; kelompok 6 RM28048 H dan RM1986 A; kelompok 7 RM28048 B dan RM1986 B; kelompok 8 RM28048 B dan
RM1986 H; dan kelompok 9 RM28048 B dan RM1986 A. Individu-
individu yang terpilih adalah individu-individu yang mewakili 9 kelompok tersebut. Secara keseluruhan, kelompok 1 memiliki individu terpilih paling sedikit
yang mewakili kelompok tersebut. Terdapat 8 individu pada kelompok ini, 5 individu terpilih dari galur BIOR1-85-193 dan 3 individu terpilih dari galur
BIOR1-85-302. Hal ini dikarenakan keterbatasan jumlah individu yang memiliki genotipe seperti kelompok 1 pada populasi ini. Kelompok 2 memiliki individu
terpilih yang paling banyak yaitu 65 dengan 29 individu berasal dari galur BIOR1-85-193 dan 36 individu berasal dari galur BIOR1-85-302. Kelompok
dengan genotipe heterozigot H pada salah satu danatau kedua daerah penanda pengapit kecenderungan memiliki jumlah individu yang lebih banyak
dibandingkan dengan kelompok dalam keadaan homozigot AB pada kedua daerah penanda pengapit.
Tabel 5. Daftar Primer SSR padi yang digunakan untuk pemetaan lanjut populasi BC
3
F
3
turunan Ciherang х B11143D.
No. Penanda Sekuen Primer
Posisi Fisik bp
Posisi Rekombinan
cM
1 RM28048
TTCAGCCGATCCATTCAATTCC
14153465 -
14153488 53.6
GCTATTGGCCGGAAAGTAGTTAGC
2 RM28064
AGGAGCGTTTGTACGAGAACACATGG
14654241 -
14654510 54.2
CGCCGCCACCTAATTGTACACC
3 RM28195
CCTAGTTCAGCTCCTGCTTACC
18082643 -
18082738 62.2
CTCAGATGTAGGGAATGTTTGC
4 RM28305
GTCATCTTCGCAAATGGTGATGG
19998669 -
19998730 71.2
GGTCGTCGTGGTGTTATTCTTGG
5 RM1986
TAACGGAGGGAGTAGTTTTC
21212975 -
21213260 73
GAACCTACATATCGAGAGCA
6 RM28433
AATAGCTGCATATACCCGGTTGG
22600596 -
22600673 80.4
TGTGTCTCTGATGATCCGTTTCG
7 RM12
TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC
27024527 -
27024556 108.2
GGTGATCCTTTCCCATTTCA
Survei polimorfisme tetua dilakukan terhadap 25 penanda SSR yang berada di sekitar atau di antara penanda pengapit flanking marker. Dari hasil survei ini
didapatkan 4 penanda SSR yang polimorfik yaitu RM28064, RM28305, RM28433, dan RM12. Kegiatan seleksi foreground tahap 2 dilakukan pada 300
individu terpilih menggunakan 4 penanda tambahan tersebut Tabel 5.
