dikocok. Jika proses inkubasi telah selesai maka tube diangkat dan didinginkan kurang lebih 15 menit. Untuk mengikat DNA ditambahkan kloroform 500 µl,
selanjutnya campuran tersebut dikocok agar menjadi homogen dan disentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Proses sentrifugasi dilakukan untuk
memisahkan bahan-bahan kimia atau fase organik dari fase air berupa supernatan. Langkah selanjutnya yaitu fase air dipisahkan dari fase organik dengan
menggunakan mikro pipet kemudian fase air dipindahkan ke dalam tube baru. Kegiatan selanjutnya adalah penambahan isopropanol dingin 500 µl dan
NaCl 300 µl, lalu disimpan dalam freezer selama 45 menit sampai 1 jam. Hasil pengendapan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit dan
cairan dalam tube dibuang. Kegiatan selanjutnya adalah proses pencucian DNA dengan menambahkan etanol 95 sebanyak 300 mikroliter, lalu disentrifugasi
pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit dan cairan dalam tube dibuang kembali dan dilakukan secara hati-hati. Proses tersebut dilakukan 2 kali. Pellet
DNA yang ada di tube dikeringkan dengan cara disimpan di dalam desikator secara terbalik agar silicagel di dalam desikator dapat menyerap cairan yang ada
dalam tube selama ± 15 menit.
3.3.3 Elektroforesis
Selama proses pengeringan pellet DNA, disiapkan agarose 1 0,33 gram agarose dalam 33 ml TAE. Untuk proses elektroforesis, ditambahkan TE 50
μl pada pellet DNA lalu sentrifugasi, diambil 3
μl DNA ditambahkan 2 μl BJ Blue Juice 10 X dan runningelektroforesis selama kurang lebih 30 menit. Hasil
elektroforesis kemudian direndam dalam larutan Etidium Bromida EtBr 10 μl
per 200 ml aquades selama 15 menit dan selanjutnya difoto pada UV transiluminator.
3.3.4 PCR Polymerase Chain Reaction Mikrosatelit
Sebelum melakukan amplifikasi PCR, DNA hasil ekstraksi diencerkan dengan aquabidest. Perbandingan antara DNA dan aquabidest tergantung dari
resolusi pita DNA genomik dari hasil ekstraksi, misalnya pengenceran 100x artinya 99
μl aquabides dan 1 μl DNA hasil ekstraksi. Primer yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari empat macam, seperti yang tertera pada tabel 3.
Tabel 3 Primer mikrosatelit Eurlings et al. 2009
Locus Primer sequence 50–30
Repeat Size range
bp Number
of alleles TA
O
C
6pa18
F: TGAGGCGTGAGTGAGATATTGATT R: CCTTCCTCTCTTCTTACCTCACCA
CA8 180–210
7 50
10pa17
F: ACACACTGTTATGGTCTACAGCTT R: CGCCATCTCATAATATTCTAATGTA
CA12 152–156 3
50 16pa17
F: AGTGAACAACTTGACTAGGCTTG R: GCTGAACACAACAAGATATCACC
CA19 143–155 6
59 71pa17
F: AGCAAACAGTGGGATAAGGTC R: AGAAAGGAGGCGAAACGAAT
CA15 152–224 15
54
Komposisi bahan untuk reaksi PCR mikrosatelit terdiri atas
Nukleas free water
, Green go taq, primer forward dan reverse, DNA isolasi. Reaksi PCR mikrosatelit tersebut dilakukan dengan menggunakan mesin PTC-100
Progammable Thermal Cycler MJ Research, Massachussetts, USA. Komposisi bahan untuk reaksi PCR Mikrosatelit dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Komponen Bahan yang Digunakan dalam Reaksi PCR .
No. Nama Bahan
1 Sampel Reaksi X Sampel Reaksi
1. Nucleas free water
2,5 μl
X x 2,5 μl
2. Green Go Taq 7,5
μl X x 7,5
μl 3. Primer
1,5 μl
X x 1,5 μl
4. Cetakan DNA
2 μl
X x 2 μl
3.3.5 Pembuatan Gel Poliakrilamid 3.3.5.1 Persiapan plate kaca pendek
Langkah awal adalah membersihkanplate hingga bersih menggunakan tissue dan ethanol 95, kemudian meneteskan 50 µl SigmaCote pada plate
menggunakan pipet mikro. Untuk meratakan SigmaCote pada seluruh permukaan plate disapu menggunakan tissue, penyapuandilakukan secara merata untuk
memastikan permukaan kaca telah terolesi SigmaCote. Kemudian bilas kelebihan SigmaCote dengan cara mencuci plate menggunakan ethanol 95 dan
tissue.Karena sisa-sisa SigmaCotebisa menyebabkan penghambatan ketika pewarnaan
3.3.5.2 Persiapan plate kaca panjang
Langkah awal adalah membersihkanplate hingga bersih menggunakan tissue dan ethanol 95, kemudian meneteskan 50 µlBind Silanc pada plate
menggunakan pipet mikro. Untuk meratakan Bind Silanc pada seluruh
permukaan plate digunakan tissue. Menyapu kaca secara merata untuk memastikan permukaan kaca telah terolesi Bind Silanc.
3.3.5.3 Perakitan lapisan plate kaca
Plate kaca panjang dan pendek yang telah siap dirakit dengan bagian yang dilapisi oleh SigmaCote dan BindSiland diletakkan di dalam rakitan, seperti yang
tertera pada gambar5.
Gambar5Contoh perakitan kaca poliakrilamid
3.3.5.4 Pembuatan larutan poliakrilamida
Pembuatan satu kaca gel akrilamit diperlukan bahan sesuai yang tertera pada tabel 5.
Tabel 5Komposisi pembuatan gel Poliakrilamid
Bahan 6
8
Akrilamid 5,7 gram
7,6 gram
Bisakrilamid 0,3 gram
0,4 gram
TBE 1x 10 ml
10 ml TEMED 50
µl 50
µl APS 500
µl 500 µl
Aquades 60 ml
60 ml
Akrilamid, bisakrilamid, TBE 1x, dan aquades dicampur dalam erlenmeyer dan distirrel selama 15 menit, kemudian pada menit ke-10
dimasukkan temed. Pada menit ke 14 dimasukkan APS, dan pada menit ke-15 memasukkan larutan ke dalam pasangan kaca yang sudah dipersiapkan, kemudian
menunggu sampai larutan memadat.
3.3.6 Loading Sampel
Kegiatan elektroforesis dilakukan pada 350 V, 40mA, 80 W selama 75 menit. Buffer untuk running TBE 1x mengandung 18mM Triz-HCl, 8.9 mM
asam borat dan 2 mM Na
2
EDTA. 3.3.7
Metode Pewarnaan
Pewarnaan dilakukan setelah kegiatan elektroforesis selesai. Pewarnaan ini terdiri dari empat bak perendaman, secara berurutan bak satu sampai dengan
empat tertera pada tabel 6.
Tabel 6 Bahan pewarnaan DNA mikrosatelit
Bak Bahan larutan
pewarna Lama
perendaman
1 Aquades 450 ml
10-15 menit Acetic acid 0,5 25 µl
Etanol 50 ml 2
Aquades 500 ml 5 menit
3 Aquades 500 ml
10-20 menit, setelah bak 3, bilas ke bak 2 selama 10 detik
Silbernitrat 0,5 gram Formaldehyde 0,6 ml
4 Aquades 500 ml
Sampai terlihat pita DNA NaOH 7,5 gram
Formaldehyde 1 ml
3.4 Analisis Data Hasil dari kegiatan analisis mikrosatelit pada daun dan kayu gaharu difoto
dan dianalisis dengan melakukan skoring pola pita yang muncul Gambar 6. Hasil interpretasi foto kemudian dianalisis dengan menggunakan software
POPGENE 32 versi 1.31 Yeh, 1999 dan NTSys Ver 2.0 Rohlf, 2008. Selain itu, digunakan juga Minitab versi 14 untuk memastikan besarnya panjang fragmen
bp dari DNA hasil amplifikasi
.
Gambar 6 Cara skoring DNA mikrosatelit
Hartati 2007 menjelaskan bahwa POPGEN versi 1.32 digunakan untuk menghitung distribusi keragaman genetik dan jarak genetik berdasarkan frekuensi
asumsi Hardy-Weinberg HW. Jarak genetik digunakan untuk analisis gerombol menggunakan metode UPGMA unweighted pair group with arithmatic avarage
pada Ntsys yang menghasilkan dendogram hubungan kekerabatan. Hasil analisis dengan software Minitab versi 14 didapatkan persamaan
hubungan antara panjang pita DNA hasil amplifikasi pada foto dengan panjang fragmen. Hasil perhitungan dengan persamaan dari Minitab versi 14 disajikan
pada Tabel 7,sedangkan grafik hubungan antara panjang foto mikrosatelit dan panjang DNA tertera pada Gambar 7. Berdasarkan analisis tersebut dapat dilihat
bahwa rentang panjang DNA teramplifikasi pada bp yang hampir sama dengan bp penelitian Eurling et al. 2009. Penggunaan persamaan bp dimaksudkan untuk
memastikan pita DNA mikrosatelit yang diskoring berada pada posisi yang benar.
Tabel 7 Hasil pendugaan panjang DNA hasil amplifikasi
Jenis Primer
Jarak pada foto [p cm]
bp Eurlings et al. 2009
bp 100,1-37,39p+15,88p
2
6pa18 3,5 180
180 4,2
210 206
10pa17 3,1 152
152 3,4
156 158
16pa17 2,7 143
131 3,4
155 153
71pa17 3,8 152
168 4,2
224 224
Keterangan : bp : panjang fragmen
Gambar 7 Grafik panjang fragmen hasil amplifikasi mikrosatelit
100 200
300 400
500 600
0,0 2,0
4,0 6,0
8,0
Pan jan
g fr ag
m e
n b
p
jarak pada foto cm
marker bp mikrosatelit
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1Amplifikasi Silang Penanda Mikrosatelit
Penggunaan primer-primer mikrosatelit jenis A.crassna 6pa18, 10pa17,16pa17, dan 71pa17dapat mengamplifikasi silang pada gaharu jenis
lainnya sampel penelitian :A.malaccensis, A.microcarpa, A.crassna, Gyrinops sp dan A.filaria. Hasil amplifikasi silang mikrosatelit disajikan pada Gambar
8.Berdasarkan gambar tersebut dapat dilihat bahwa hasil amplifikasi silang menunjukkan panjang fragmen yang berbeda-beda sesuai Eurlings et al. 2009.
Gambar 8 Hasil amplifikasi silang mikrosatelit
Amplifikasi silang penanda mikrosatelit dari gaharu jenis A.crassna berhasil dilakukan dengan kisaran panjang fragmen bp yang diharapkan.Syarat utama
terjadinya amplifikasi DNA dengan satu jenis primer adalah apabila primer tersebut mempunyai urutan basa nukleotida yang merupakan komplemen dari
kedua untai cetak DNA pada posisi yang berlawanan Hartati et al.2007.Adapun komposisi lokus polimorfik disajikan dalam Tabel 8 dan 9.
Tabel 8 Komposisi lokus polimorfik untuk masing-masing primer
Primer Panjang fragmen bp Keterangan
Size range bp 6pa18
A
158
, A
164
, A
180
, A
186
, A
196
Polimorfik 180–210
10pa17 A
152
, A
153
, A
154
Polimorfik 152–156
16pa17 A
143
, A
145
, A
147
Polimorfik 143–155
71pa17 A
158
, A
186
, A
206,
A
210
, A
216
, A
224
Polimorfik 152–224
Tabel 9Panjang fragmen hasil amplifikasi silang tiap jenis gaharu
Allele bp
143 145 147 151 152 153 154 158 164 180 186 194 196 206 210 216 224
A.malaccensis
√ √
√ - √ √
√ - Φ - √ - √ - - - -
A.microcarpa
√ √
√ - √ √
√ Φ - - √ - - - √ - -
A.crassna
√ √ - - - √ - - Φ
√ √ - √ - - √
√
Gyrinops sp.
√ √ - - √
√ - - - √ - - - √ - - -
A.filaria
√ √ - - √
√ - Φ - - √ - - - - √ -
Keterangan : - = ada dalam A.crassna Eurlings et al. 2009, tidak ada dalam penelitian
Φ = tidak ada dalam A.crassna Eurlings et al. 2009, ada dalam penelitian
√ =ada dalam A.crassna Eurlings et al. 2009 dan penelitian
allel 155-156, 168-178, dan 198-202 memiliki tanda: -
Jenis
