3.3 Prosedur Penelitian
Tahapan penelitian mengikuti alur seperti pada Gambar 4.
Gambar 4 BaganAlur Penelitian
3.3.1 Pengambilan Sampel Daun
Sampel pada penelitian ini yaitu daun dan kayu dari pohon gaharu.Sampel daun gaharu diambil dari hutan alam dan hutan tanaman.Sampel dari hutan alam
diambil dari Propinsi Riau, Kabupaten Lombok, dan Propinsi Kalimantan Selatan.Sedangkan sampel kayu diambil dari toko kayu gaharu Semplak, Bogor,
Jawa Barat.
3.3.2 Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dari daun dan kayugaharudilakukan dengan menggunakan metode CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide. Sampel daun 2 x 2 cm
digerus dengan menggunakan nitrogen cair di dalam pestel yang bersih, sedangkan pada sampel kayu dibor untuk mendapatkan serbuk kayu. Hasil
gerusan daun dan serbuk kayu selanjutnya dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml, lalu ditambahkan 500µl larutan buffer ekstrak Tris-HCl, EDTA, NaCl, CTAB,
aquades, dll dan 100 µl PVP 1. Fungsi buffer ekstrak dan PVP adalah mempercepat proses penghancuran.
Tahapan selanjutnya dilakukan proses inkubasi di dalam waterbath selama 1 jam pada suhu 65
o
C-70
o
C. Selama inkubasi setiap 15 menit diangkat dan
Pemilihan Populasi Hutan Alam dan Tanaman Gaharu untuk Penelitian
Pengambilan Sampel
Amplifikasi Silang Ekstraksi atau Isolasi DNA, Elektroforesis,
PCR, Mikrosatelit dan Pewarnaan Gel
Analisis Keragaman Genetik Gaharu Hutan Alam dan Tanaman
Pendugaan Kayu Gaharu dengan Asal – usul tidak Jelas
dikocok. Jika proses inkubasi telah selesai maka tube diangkat dan didinginkan kurang lebih 15 menit. Untuk mengikat DNA ditambahkan kloroform 500 µl,
selanjutnya campuran tersebut dikocok agar menjadi homogen dan disentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Proses sentrifugasi dilakukan untuk
memisahkan bahan-bahan kimia atau fase organik dari fase air berupa supernatan. Langkah selanjutnya yaitu fase air dipisahkan dari fase organik dengan
menggunakan mikro pipet kemudian fase air dipindahkan ke dalam tube baru. Kegiatan selanjutnya adalah penambahan isopropanol dingin 500 µl dan
NaCl 300 µl, lalu disimpan dalam freezer selama 45 menit sampai 1 jam. Hasil pengendapan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit dan
cairan dalam tube dibuang. Kegiatan selanjutnya adalah proses pencucian DNA dengan menambahkan etanol 95 sebanyak 300 mikroliter, lalu disentrifugasi
pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit dan cairan dalam tube dibuang kembali dan dilakukan secara hati-hati. Proses tersebut dilakukan 2 kali. Pellet
DNA yang ada di tube dikeringkan dengan cara disimpan di dalam desikator secara terbalik agar silicagel di dalam desikator dapat menyerap cairan yang ada
dalam tube selama ± 15 menit.
3.3.3 Elektroforesis
Kategori