3.3.1. Persiapan Sampel
Sampel yang digunakan adalah tanah pertambangan batubara yang berasal dari Sumatera Selatan. Sampel dihancurkan secara aseptis dengan menggunakan
mortar, lalu disaring dengan menggunakan saringan berukuran 100 mesh. Sampel hasil saringan tanah pertambangan batubara inilah yang kemudian akan
digunakan.
3.3.2. Pembuatan Medium 3.3.2.1. Medium
Minimal Salts Medium MSM-DBT
Medium Minimal Salts Medium MSM dibuat dengan cara menimbang sebanyak 2 ml gliserol; 4 g NaH
2
PO
4
.H
2
O; 4 g K
2
HPO
4
.3H
2
O; 2 g NH
4
Cl; 0,2 g MgCl
2
.6H
2
O; 0,001 g CaCl
2
.2H
2
O dan 0,001 g FeCl
3
.6H
2
O, ditambahkan aquades hingga volumenya mencapai 1 liter, kemudian diaduk sampai homogen
Gallagher et al., 1993. Medium MSM-DBT dibuat dengan cara menambahkan batubara serbuk
sebanyak 10 bv berukuran 200 mesh pada medium MSM. Batubara yang ditambahkan sebelumnya sudah dicuci dengan menggunakan aquades. Medium
tersebut kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. DBT disiapkan secara terpisah dari medium basal, DBT
dilarutkan dalam alkohol 70 hingga 10 mM, kemudian medium MSM steril ditambahkan 0,1 mM DBT. Medium MSM-DBT ini adalah medium MSM-DBT
cair sedangkan untuk keperluan plating, medium tersebut ditambahkan 1,5 agar Maghsoudi et al., 2000.
3.3.2.2. Medium Trypticase Soy Agar TSA
Medium Trypticase Soy Agar TSA dibuat dengan cara menimbang 40 g media Lampiran 1, kemudian ditambahkan aquades hingga volumenya mencapai
1 liter dan dipanaskan hingga homogen. Medium tersebut kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
3.3.3. Pengayaan Sampel Tanah
Pengayaan sampel tanah pertambangan batubara dilakukan untuk mengaktifkan bakteri desulfurisasi. Sampel tanah pertambangan batubara yang
telah dihaluskan 100 mesh sebanyak 100 g dicampur dengan 10 g batubara bubuk steril 200 mesh dan 0,1 mM DBT di dalam beaker glass berukuran 500
ml, kemudian ditutup dengan menggunakan penutup yang terbuat dari kaca. Pengayaan sampel tanah dilakukan selama + 30 hari pada suhu ruang. Selama
proses pengayaan tanah berlangsung kondisi tanah tetap dijaga kelembabannya, dengan cara memberikan beberapa tetes aquades steril setiap hari. Pencuplikan
tanah dilakukan pada hari ke-0 jam ke-3, 7, 14, 21 dan 28. Sampel tanah pada waktu-waktu tersebut diambil untuk diisolasi dan dihitung komunitas bakteri total
dan bakteri desulfurisasi Gallagher et al., 1993.
3.3.4. Isolasi Bakteri Total IBT
IBT dilakukan pada sampel tanah pertambangan batubara asal Sumatera Selatan sebelum dan sesudah pengayaan DBT dan batubara. Sebanyak 1 g sampel
tanah pertambangan batubara 100 mesh dimasukkan ke dalam 9 ml larutan fisologis NaCl 0,85, kemudian dilakukan seri pengenceran, dengan cara
mengencerkan 1 ml sampel ke dalam 9 ml larutan fisiologis NaCl 0,85. Hasil setiap seri pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml dan ditumbuhkan pada medium
TSA cawan dengan teknik sebar. Setelah itu, diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam.
3.3.5. Isolasi Bakteri Desulfurisasi IBD
IBD pengguna DBT dilakukan dengan dua cara yaitu metode langsung dan tidak langsung diperkaya.
3.3.5.1. Isolasi Bakteri Desulfurisasi Langsung IBDL
Isolasi bakteri desulfurisasi langsung IBDL dilakukan dengan cara 10 g tanah yang diperkaya dengan DBT dan batubara, dicampur dengan 90 ml sodium
pyrophosphat Na
4
P
2
O
7
0,1 sebagai buffer, kemudian dikocok selama 20 menit pada rotary shaker dengan kecepatan 200 rpm Young et al., 2006. Setelah itu,
suspensi diencerkan dengan melakukan seri pengenceran, dengan cara mengencerkan 1 ml sampel ke dalam 9 ml larutan fisiologis NaCl 0,85. Hasil
setiap seri pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml dan ditumbuhkan pada medium TSA cawan dengan teknik sebar. Setelah itu, diinkubasi pada suhu ruang selama
48 jam.
3.3.5.2. Isolasi Bakteri Desulfurisasi Tidak Langsung Diperkaya IBDTL
Isolasi bakteri desulfurisasi tidak langsung diperkaya IBDTL dilakukan dengan cara 5 g tanah yang diperkaya dengan DBT dan batubara dimasukkan ke
dalam erlenmeyer yang berisi 95 ml MSM-DBT. Kultur diinkubasi pada rotary
shaker berkecepatan 150 rpm pada temperatur ruang selama 3 hari. Kemudian 10 vv kultur ini diinokulasi ke dalam medium baru dan diinkubasi kembali.
Hal ini dilakukan sampai tiga kali transfer, untuk memperkaya jumlah bakteri Kirimura et al., 2001. Pada kultur terakhir pengayaan, 1 ml sampel diambil
kemudian dilakukan seri pengenceran, dengan cara mengencerkan 1 ml sampel ke dalam 9 ml larutan fisiologis NaCl 0,85. Hasil setiap seri pengenceran
diambil sebanyak 0,1 ml dan ditumbuhkan pada medium TSA cawan dengan teknik sebar. Setelah itu, diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang.
3.3.6. Pemurnian Isolat
Seluruh isolat bakteri yang diperoleh dimurnikan sampai menghasilkan isolat bakteri tunggal. Apabila dari proses isolasi menghasilkan isolat yang
bermacam-macam maka dipisahkan tiap isolat bakteri dengan cara mengambil sebagian kecil koloni dengan menggunakan ose kemudian diinokulasikan pada
medium TSA cawan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Proses pemurnian dilakukan sampai menghasilkan isolat bakteri yang murni atau tunggal,
yang diketahui dari pengamatan morfologi pada pewarnaan Gram. Koloni bakteri yang telah dimurnikan disimpan sebagai kultur stok di dalam medium TSA miring
pada suhu 4 C.
3.3.7. Seleksi Isolat Bakteri Desulfurisasi 3.3.7.1. Seleksi Bakteri Desulfurisasi pada Medium MSM-DBT Agar
Setiap isolat bakteri desulfurisasi yang diperoleh, pada medium TSA yang berumur 1 hari diambil sebagian kecil koloni dengan menggunakan ose kemudian
diinokulasikan pada medium MSM-DBT agar cawan dan selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Pertumbuhan setiap isolat bakteri diamati pada
medium MSM-DBT agar. Tiga isolat bakteri yang memiliki pertumbuhan tertinggi pada media MSM-DBT agar disimpan sebagai kultur stok di dalam
medium MSM-DBT agar miring pada suhu 4 C. Kultur tersebut digunakan
sebagai kultur untuk tahapan seleksi berikutnya.
3.3.7.2. Seleksi Bakteri Desulfurisasi pada Medium MSM-DBT Cair
Tiga isolat bakteri desulfurisasi yang memiliki pertumbuhan tertinggi pada medium MSM-DBT agar yang berumur 1 hari diinokulasikan sebanyak satu ose
ke dalam 30 ml medium MSM-DBT. Kemudian diinkubasi pada rotary shaker berkecepatan 120 rpm pada temperatur ruang selama 24 jam. Kultur inokulum
sebanyak 10 vv diinokulasikan ke dalam 200 ml medium MSM-DBT dan diinkubasi pada suhu ruang dengan agitasi 120 rpm. Pencuplikan dilakukan pada
jam ke-0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 24 untuk pengukuran enumerasi sel, pH dan desulfurisasi DBT. Enumerasi sel dilakukan dengan cara mengukur total plate
count, pH diukur dengan pH meter. Desulfurisasi DBT dilakukan dengan cara mengukur sulfat yang terbentuk.
Sulfat ditentukan dengan metode kekeruhan barium sulfat. Lima ml gliserol 20 vv dalam air ditambahkan ke dalam sampel cair dan dikocok dengan kuat
hingga homogen. Satu ml barium klorida 10 vv dalam HCl 5 vv ditambahkan dan dikocok dengan kuat untuk memastikan presipitat barium sulfat
yang terbentuk tercampur merata dalam larutan gliserol. Kemudian aquades ditambahkan sampai volume total 10 ml, dikocok merata dan diukur
kekeruhannya dengan Visible Spectrophotometer pada panjang gelombang 460
nm, terhadap larutan blanko Gleen dan Quastel, 1953 dalam Burlage et al., 1998. Isolat bakteri yang memiliki kandungan sulfat tertinggi akan di uji lanjut
untuk analisis hasil desulfurisasi DBT dengan menggunakan UV-Vis Spectrophotometer.
3.3.8. Analisis Hasil Desulfurisasi DBT dari Bakteri Terseleksi dengan menggunakan
UV-Vis Spectrophotometer
Sampel sebanyak 3 ml selama pencuplikan pada fase eksponensial isolat yang terseleksi diasamkan sampai pH 2 dengan menggunakan HCl 1 N. Setelah
itu sampel diukur kadar DBT dengan menggunakan UV-Vis Spectrophotometer
pada panjang gelombang 328 nm Rhee et al., 1998. Konsentrasi kadar DBT pada sampel diketahui dengan cara membandingkan nilai absorbansi dengan
kurva standar.
3.3.9. Analisis Data
Kategori