selama 1 menit. Buang Collection tube yang menyambung filtrase, masukkan Collumn ke dalam collection tube baru. Kemudian Cuci dengan buffer baru AW 1
tambahkan 500 µl Buffer AW 1. Centrifuge 800 rpm selama 1 menit. Buang Collection Tube yang mengandung filtrat, masukkan Collection tube baru.
Lalu cuci dengan buffer AW2 tambahkan 500 µl buffer AW2, centrifuge 8000 rpm selama 1menit. Buang Collection Tube yang mengandung filtrat masukkan Collumn
ke dalam Collection tube baru. Lalu Cuci dengan etanol tambahkan 500 µl etanol, Centrifuge 800 rpm selama 1 menit. Buang Collection tube yang mengandung filtrat.
Masukkan Collumn ke dalam Collection tube baru. Kemudian di centrifuge dengan 14.000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan Dry Spi. Lalu masukkan Collumn
ke dalam tube baru. Buka tutupnya, inkubasi dalam 56 C
selama 3 menit. Kemudian buang Collection tube tempat Collumn pada Microcentrifuge 1,5 ml, masukkan 20-
150 µl buffer AV. Buang Collumn simpan RNA yang telah di ekstraksi dalam 70 C.
III. 3. 4. Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction RT – PCR
RT–PCR adalah teknik yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya RNA virus Dengue Serotipe 4 Den-4 dengan menggunakan primer Den-4.
Pertama-tama dipersiapkan Master mix yang dibuat dengan mencampurkan 25 µl 2x reaksi mix buffer yang terdiri dari 0,4 mM dNTP 3,2 mM MgSO4
dengan 20 µl larutan yang berisi campuran dari 1µl dari 10 µl primer Den-4, 2 µl superscript III RT, 4 µl MgSO dan aquades Eva Haris et al, 1998. Master mix ini
dicampurkan dengan pipeting dan di Spin down.
Marliana Lubis : Frekuensi Virus Dengue Serotipe 4 Dari Serum Penderita DD BBD Di Rumah Sakit Kota Medan Menggunakan RT-PCR, 2009
USU Repository © 2008
RNA hasil ekstraksi dipersiapkan dengan memanaskan tabung pada 65 C
selama 5 menit dengan menggunakan block heater, kemudian ditempatkan di dalam es selama memepersiapkan master mix. Kemudian 5 µl RNA hasil ekstraksi
ditambahkan ke dalam master mix, kemudian di sentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Lalu dimasukkan kedalam mesin PCR.
Langkah Reverse Transcriptase RT dilakukan selam 30 menit untuk menghasilkan cDNA, kemudian diamplifikasikan dengan langkah Polymerase Chain
Reaction PCR berikut : 94 C selama 2 menit untuk denaturasi inisial, 94
C selama 45 menit untuk denaturasi, 51
C selama 1 menit untuk annealing dan 68 C
selama 7 menit. Produk PCR ini disimpan pada suhu 4 C sebelum digunakan.
III. 3. 5. Elektroforesis
Untuk menentukan jenis Serotipe virus Dengue yang telah di amplifikasi maka dilakukan elektroforesis. Cara melakukan elektroforesis adalah sebagai berikut
: Mula-mula dibuat agarose 2 dengan cara : 10 ml 1X TAE buffer
dicampur dengan 100 ml aquades pengenceran 10 x, lalu 50 ml larutan 1X TAE buffer tersebut dicampurkan dengan 1 gram agarose. Lalu dipanaskan dalam
microwave sampai mendidih, kemudian ditambahkan 1:1000 SYBER safe–TM dan tuangkan dalam cetakan agarose gel yang telah disediakan dengan jumlah sumuran
well sesuai kebutuhan.
Marliana Lubis : Frekuensi Virus Dengue Serotipe 4 Dari Serum Penderita DD BBD Di Rumah Sakit Kota Medan Menggunakan RT-PCR, 2009
USU Repository © 2008
Setelah gel agarose mengeras, dimasukkan ke dalam tangki chamber elektroforesis yang berisi 1X TAE buffer. Kemudian 5-10 µl hasil PCR dicampur
dengan 1µl blue juice 2x dan dimasukkan kedalam sumur pada gel agarose, lalu masukkan pula secara berturut-turut 10 µl marker, 5–10 µl kontrol positif dan 5–10 µl
kontrol negatif pada sumur-sumur berikutnya. Kontrol positif adalah hasil amplikasi PCR yang berisi master mix yang dicampur RNA virus Den-4 dan kontrol negatif
adalah hasil amplifikasi PCR yang berisi master mix yang dicampur aquades. Power supply kemudian dinyalakan pada posisi 80–100 V, 400 mA dan waktu 45 menit,
DNA akan bergerak dari kutup negatif kekutup positif.
III. 3. 6. Gel Imaging
