variabel, yang secara umum dibagi menjadi dua kelompok yaitu 7 variabel pengukuran dan 21 variabel turunan. Variabel turunan dapat dihitung jika variabel
pengukuran telah diketahui. Adapun simbol dan keterangan variabel ditampilkan
pada Tabel 2. Bagian-bagian variabel yang diukur tersebut dalam daun ditunjukkan dalam Gambar 3. Teknis pengukuran variabel pengukuran adalah
dengan mengambil 5 sampel daun setiap herbarium yang digunakan sebagai ulangan, untuk memudahkan pengukuran dan penelusuran data dalam penomoran
sampel daun digunakan kaidah penomoran searah jarum jam. Sebagaimana
ditunjukkan dalam Gambar 4. 3.3.4. Analisis Jenis Berdasarkan Peta Sebaran Jenis
Variabel pengukuran dan variabel turunan dari masing-masing jenis dilakukan uji korelasi, dengan menggunakan Minitab 14. Dari hasil uji korelasi
dapat diketahui variabel yang memiliki korelasi yang kuat antara dua variabel. Kemudian data yang memenuhi kriteria r 0.7 dilakukan pemetaan. Hasil
pemetaan tersebut dinamakan Peta Sebaran Jenis. Setelah didapatkan peta sebaran jenis dilanjutkan dengan penyeleksian hasil peta, peta sebaran jenis yang baik
menunjukkan munculnya 2 klaster gerombol titik hasil uji korelasi yang jelas. Dari dua klaster yang berjauhan dilakukan penelusuran ulang untuk
mengetahui nama jenis klaster. Jenis yang memiliki titik hasil uji korelasi yang berdekatan dengan klaster yang telah diidentifikasi dinamakan sesuai nama
klaster yang bersangkutan.
3.3.5. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan untuk pengklarifikasian dengan penanda RAPD. Pengambilan sampel dilakukan secara acak pada individu yang terletak
pada klaster S. parvifolia dan S. leprosula masing-masing sebanyak 5 individu, dan diambil juga 10 individu yang berada pada klaster Shorea sp campuran dari
individu S. leprosula dan S. parvifolia, dengan kriteria 5 individu S. parvifolia yang masuk dalam klaster S. leprosula dan 5 individu dari S. leprosula yang
masuk dalam klaster S. parvifolia.
Tabel 2 Simbol dan Keterangan Variabel Pengukuran Morfologi Daun.
No Simbol Keterangan
1 LL Panjang
daun leaf length
2 PL
Panjang petiole petiole length 3 LW
Lebar daun
leaf width 4
WP Jarak daun terlebar ke petiole widest leaf to petiole
5 DL Panjang
dometiana dometiana length
6 NL
Besar sudut pertulangan daun number of lobes 7
NV Jumlah tulang daun number of veinations
8 LLPLR Leaf Length-Petiole Length Ratio
9 LLLWR Leaf Length-Leaf Wide Ratio
10 LLWPR Leaf Length-Widest leaf to Petiole Ratio 11 LLDLR Leaf Length-Dometiana Length Ratio
12 LLNLR Leaf Length-Number of Lobes Ratio 13 LLNVR Leaf Length-Number of Veination Ratio
14 PLLWR Petiole Length- Leaf Wide Ratio 15 PLWPR Petiole Length- Widest Leaf to Petiole Ratio
16 PLDLR Petiole Length- Dometiana Length Ratio 17 PLNLR Petiole Length- Number of Lobes Ratio
18 PLNVR Petiole Length- Number of Veination Ratio 19 LWWPR Leaf Wide- Widest Leaf to Petiole Ratio
20 LWDLR Leaf Wide- Dometiana Length Ratio 21 LWNLR Leaf Wide- Number of Lobes Ratio
22 LWNVR Leaf Wide- Number of Veination Ratio 23 WPDLR Widest Leaf to Petiole - Dometiana Length Ratio
24 WPNLR Widest Leaf to Petiole - Number of Lobes Ratio 25 WPNVR Widest Leaf to Petiole - Number of Veination Ratio
26 DLNLR Dometiana Length- Number of Lobes Ratio 27 DLNVR Dometiana Length- Number of Veination Ratio
28 NLNVR Number of Lobes - Number of Veination Ratio
Gambar 3 Karakter Morfologi Variabel Pengukuran
Sumber: Gambar Pribadi
1
3.3.6. Ekstraksi ADN
Prosedur ekstraksi ADN menggunakan metode Mini kit Qiagen untuk 16 sampel dan 4 sampel dengan metode CTAB. Perbedaan metode tersebut tidak
mempengaruhi munculnya pita pada gel agarose. Pada metode CTAB, pertama yang dilakukan adalah melakukan pemotongan sampel daun yang telah sesuai
dengan nomor individu dan asal lokasi. Pemotongan dilakukan pada sebagian kecil dari daun yang meliputi sebagian kecil dari ujung daun, pangkal daun,
bagian sisi daun, dan bagian tengah daun dan. Hal ini dilakukan karena peneliti tidak tahu letak ADN yang paling banyak terletak di bagian daun yang mana.
Langkah kedua adalah menggerus potongan kecil daun dengan alat mortal beserta pestel dengan bahan nitrogen cair, sehingga didapatkan serbuk. Serbuk
kemudian dipindahkan kedalam microtube berukuran 1,5 mL. Berikutnya berikutnya tambahkan 800 uL larutan buffer ekstrak dan 10 uL PVP 2, lakukan
vortex secepatnya setelah kedua bahan kimia ditambahkan dalam microtube, agar serbuk tidak mengendap. Adapun komposisi dari Buffer ekstrak metode ini
ditunjukkan pada Tabel 3.
Langkah keempat dilakukan inkubasi microtube, dalam inkubator dengan suhu 65
C, selama 45 – 60 menit dan setiap 15 menit dilakukan pengocokan bolak-balik dengan tujuan untuk meratakan semua bagian dalam microtube.
Sehingga ADN akan mudah keluar dari sel. Kelima, microtube diangkat dari
Gambar 4 Urutan Penomoran Daun
Sumber: Foto Pribadi 2
3 4
5
inkubator didiamkan pada suhu ruangan selama 5 – 10 menit, kemudian ditambahkan 500 uL IAA chloroform pada setiap sampel, disentrifuse selama 2
menit pada 13000 rpm, sambil menunggu sentrifuse selesai dapat digunakan untuk menyiapkan microtube yang baru.
Tabel 3 Komposisi Buffer Ekstrak Metode CTAB
No Bahan Kimia
1 x Reaksi 20 x Reaksi
1 Psd H2O
380 uL 7600 uL
2 1M Tris – HCl pH 9,0
100 uL 2000 uL
3 5 M NaCl
280 uL 5600 uL
4 0.5 M EDTA
40 uL 800 uL
5 10 CTAB
200 uL 4000 uL
6 β - Merchaptoetanol
5 uL 100 uL
Langkah keenam, microtube diangkat dari sentrifuse, supernatannya diambil dengan menggunakan pipet mikro berukuran 100 uL, supernatant dipindahkan ke
dalam microtube baru. Ketujuh, 700 IAA chloroform ditambahkan dalam microtube
yang telah diisi supernatant. Kemudian disentrifuse selama 2 menit pada 13000 rpm. Setelah selesai supertanant diambil dengan pipet mikro ukuran
100 uL, dipindahkan ke microtube yang baru. Langkah kedelapan, 300 uL isopropanol dingin dan 20 uL NaOC atau NaCl
1 M ditambahkan dalam microtube, kocok kemudian dimasukan dalam freezer selama 45 – 60 menit. Setelah itu microtube diangkat dari freezer, disentrifuse
selama 2 menit pada 13000 rpm. Cairan yang berada dalam microtube dibuang semua dengan hati-hati supaya pellet ADN tidak terbuang. Kesembilan, dengan
microtube yang sama ditambahakan etanol 70 , disentrifuse selama 2 menit pada
13000 rpm. Larutan dalam microtube dibuang, kemudian ditambahkan etanol 100, disentrifuse larutan dalam microtube dibuang kembali, kemudian ditiriskan
selama 5 menit pada desikator. Kesepuluh, microtube yang berisi ADN ditambahkan 30 uL TE. Supaya mempercepat penyampuran dapat dilakukan
dengan memvortex atau menyentil microtube sampai yakin TE bercampur dengan pellet ADN.
Langkah kesebelas merupakan tahap pengujian keberadaan ADN hasil ekstraksi dengan teknik elektroforesis agarose 2, bahan yang diperlukan adalah
agarose larutan TAE Tris Acetate with EDTA. Pertama adalah membuat gelagar, dengan melarutkan agaros 0,66 gram dengan mencampurkan 33 mL
larutan TAE. Larutan tersebut dipanaskan dalam microwave sampai mendidih, kemudian didinginkan dalam suhu ruangan sebentar untuk mengurangi
gelembung udara, baru dituang kedalam cetakan gel. Cetakan jel tersebut telah dipasang sisicomb yang berfungsi untuk membuat cetakan sumur gelwell
elektroforesis. Gel kemudian di dinginkan sampai membeku. Sambil menunggu gel membeku, siapkan tray yang akan digunakan untuk mencampur ADN dengan
blue juice . Setelah yakin gel membeku, ambil sisircomb. Masukan gel dalam bak
elektroforesis yang telah diisi dengan larutan TAE. Ambil 4 uL ADN dari mikro tube
dengan pipet mikro, tuangkan dalam tray, campurkan 3 uL blue juice. Dengan pipet mikro ambil 7 uL campuran ADN dan blue juice dan masukkan
kedalam sumur gel elektroforesis, hati-hati jangan sampai campuran ADN dan blue juice
tersebar keluar sumur gel. Setelah semua campuran ADN dan blue juice dimasukkan, tutup bak elektroforesis dan hidupkan power supply, running dengan
menggunakan voltage kostan 100 volt, selama 30 – 40 menit. Gel yang telah dielektroforesis dilakukan pewarnaan dengan menggunakan
larutan ethidium bromide EtBr selama kurang lebih satu jam. Keberadaan ADN dapat dilihat dengan menggunakan ultraviolet transluminator.
Perbedaan dengan metode Mini Kit Qiagen tahap pertama disebut tahap prespitasi yaitu tahap menggerus daun berukuran 2 x 1 cm dengan bantuan
nitrogen cair sehingga menjadi bubuk. Bubuk dimasukkan dalam microtube 2 mL, kemudian ditambahkan 400 uL buffer AP1 dan 4 uL RNAse A 100 mgmL.
Larutan tersebut kemudian dikocok dengan vortex. Setelah divortex larutan diinkubasi dalam water bath selama 10 menit pada suhu 65
o
C, dengan diselingi pengocokan selama 2-3 kali selama inkubasi dilakukan. Setelah selesai 130 uL
buffer AP 2 ditambahkan dalam mikrotube dan divortex, kemudian diinkubasi
dalam larutan es selama 5 menit. Setelah selesai disentrifuse selama 5 menit pada 13000 rpm. Cairan dalam microtube dimasukkan kedalam QIAShedder spin
column yang terdapat pada koleksi tabung 2 mL dan disentrifuse selama 2 menit
pada kecepatan 13000 rpm. Larutan yang mengalir melalui fraksi dipindahkan dalam microtube yang baru tanpa penambahan. Kemudian 1,5 volume buffer AP
3E buffer sebelumnya ditambahkan etanol ditambahkan pada larutan bersih dan dicampurkan dalam microtube. Larutan DNeasy mini spin column sebanyak
650uL ditambahkan dalam microtube kemudian disentrifuse pada 8000 rpm selama 2 menit, kemudian cairan yang melewati fraksi dibuang.
Tahap kedua disebut tahap pencucian dimulai dengan menempatkan DNeasy column
pada microtube yang baru kemudian ditambahkan 500 uL buffer AW. Microtube
tersebut disentrifuse selama 1 menit pada 8000 rpm. Cairan yang melewati dibuang, kegiatan ini dilakukan dua kali, kemudian disentrifuse selama
2 menit pada 13000 rpm. Tahap ketiga disebut tahap elution, dilakukan dengan menyimpan DNeasy
column pada 2 mL microtube, 100 uL larutan buffer AE hangat 65
o
C dicampurkan dalam membran DNeasy, kemudian diinkubasi selama 5 menit pada
suhu ruangan. Setelah selesai microtube disentrifuse selama 1 menit pada 8000 rpm, kegiatan ini dilakukan 2 kali, sehingga akan didapatkan ADN hasil ekstraksi
sebanyak 200 uL. Tahapan berikutnya adalah uji kualitas ADN, secara teknis dalam uji
kualitas ADN baik dengan metode CTAB maupun metode Mini kit Qiagen tidak jauh berbeda, sehingga tidak diuraikan lebih jauh.
3.3.7. Proses PCR-RAPD
