pada kecepatan 13000 rpm. Larutan yang mengalir melalui fraksi dipindahkan dalam microtube yang baru tanpa penambahan. Kemudian 1,5 volume buffer AP
3E buffer sebelumnya ditambahkan etanol ditambahkan pada larutan bersih dan dicampurkan dalam microtube. Larutan DNeasy mini spin column sebanyak
650uL ditambahkan dalam microtube kemudian disentrifuse pada 8000 rpm selama 2 menit, kemudian cairan yang melewati fraksi dibuang.
Tahap kedua disebut tahap pencucian dimulai dengan menempatkan DNeasy column
pada microtube yang baru kemudian ditambahkan 500 uL buffer AW. Microtube
tersebut disentrifuse selama 1 menit pada 8000 rpm. Cairan yang melewati dibuang, kegiatan ini dilakukan dua kali, kemudian disentrifuse selama
2 menit pada 13000 rpm. Tahap ketiga disebut tahap elution, dilakukan dengan menyimpan DNeasy
column pada 2 mL microtube, 100 uL larutan buffer AE hangat 65
o
C dicampurkan dalam membran DNeasy, kemudian diinkubasi selama 5 menit pada
suhu ruangan. Setelah selesai microtube disentrifuse selama 1 menit pada 8000 rpm, kegiatan ini dilakukan 2 kali, sehingga akan didapatkan ADN hasil ekstraksi
sebanyak 200 uL. Tahapan berikutnya adalah uji kualitas ADN, secara teknis dalam uji
kualitas ADN baik dengan metode CTAB maupun metode Mini kit Qiagen tidak jauh berbeda, sehingga tidak diuraikan lebih jauh.
3.3.7. Proses PCR-RAPD
ADN hasil ekstraksi diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR teknik yang digunakan adalah RAPD. Kombinasi primer yang digunakan adalah primer
universal hampir terdapat di semua tumbuhan. Primer yang digunakan adalah OPO–13, OPY–3 dan OPY-13. Urutan nukleotida dari masing-masing primer
secara lebih terperinci disajikan dalam Tabel 4.
Primer yang akan digunakan sebelumnya dilakukan pengenceran terlebih dahulu, dengan tujuan untuk menghindari hablurnya pita ADN pada saat running
elektroforesis. Pengenceran dilakukan dengan mengambil primer tersebut sebanyak 1 uL dan ditambahkan 4 uL H
2
O yang telah di autoklaf jika pengenceran yang diinginkan adalah 5X. Pengenceran yang dilakukan dalam penelitian ini
adalah 5X, dan 10X. Adapun bahan-bahan yang dicampurkan dalam satu microtube
pada proses PCR-RAPD terdapat pada Tabel 5. Tabel 4
Nama Primer dan Susunan Basa dalam Proses PCR-RAPD
No Primer Susunan
Basa
1 OPO-13 5’-GTCAGAGTCC-3’
2 OPY-3 5’-ACAGCCTGCT
-3’ 3 OPY-13
5’-CACAGCGACA-3’
Tabel 5 Komposisi Bahan dalam Proses PCR-RAPD
No Bahan Kimia
1 x Reaksi
1 Psd H
2
O 7,5 uL
2 Enzim Taq DNA polymerase
2,5 uL 3
Primer oligonukleid 1,5 uL
4 DNA pekat
1,5 uL
3.3.8. Analisis Genetik
Hasil elektroforesis akan menunjukkan beberapa pitaband. Berdasarkan identifikasi pita dapat ditemukan lokus penanda yang membedakan satu individu
dengan individu lain. Dengan menggunakan lokus penanda secara kasar, diagnosis jenis dapat dilakukan. Diagnosis jenis berdasarkan lokus penanda secara umum
dilakukan sebelum scoring dilakukan. Scoring
dilakukan dengan memberi nilai 1 satu bagi lokus yang memiliki pita, dan memberi nilai 0 nol bagi lokus yang tidak memiliki pita. Adapun
ketentuan yang perlu diperhatikan dalam penentuan nomor lokus yang secara umum digunakan pada penelitian-penelitian sebelumnya adalah penomoran lokus
dimulai dari pita yang memiliki berat molekul yang paling ringan. Dalam gel agarose pita tersebut ditunjukkan dengan jarak yang paling jauh dari sumur gel.
Data hasil scoring dari masing-masing primer kemudian dianalisis dengan software
POPGENE versi 32 dan NTSys.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil
