38
BAB III METODE PENELITIAN
Pada penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Metode penelitian ini meliputi penyiapan bahan, skrining fitokimia, isolasi minyak atsiri dan pembuatan
ekstrak etanol serta uji aktivitas antibakteri secara in vitro dengan metode difusi agar. Penelitian dilakukan di Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi dan
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi.
3.1 Alat – Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, autoklaf Fisons, blender Miyako, desikator, freeze dryer Modulio, inkubator
Memmert, kompor Miyako, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF 1200L, lemari pendingin Uchida, mikroskop, neraca listrik Vibra AJ, oven Fisher,
penangas air Yenaco, pipet mikro Eppendorf, rotary evaporator Haake D, seperangkat alat destilasi air, silinder logam,
alat destilasi air,
spektrofotometer visibel Dynamic.
3.2 Bahan – Bahan
Bahan penelitian yang digunakan adalah bunga kecombrang, nutrient agar, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, dan Pseudomonas
aeruginosa, bahan kimia yang digunakan adalah berkualitas pro analisa yaitu ,alfa naftol, asam klorida pekat, asam asetat anhidrida, asam asetat glasial, asam nitrat
pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismut III nitrat, etanol,
Universitas Sumatera Utara
39 etilasetat, n-heksan, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform,
metanol, natrium hidroksida, natrium klorida, natrium sulfat anhidrat, raksa II klorida, serbuk magnesium dan timbal II asetat. Etanol 96 hasil destilasi.
3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi
Pembuatan larutan pereaksi besi III klorida 1, Bouchardat, Dragendorff, Mayer, Molish dilakukan menurut DitJen POM, 1995, asam
klorida 2 N, asam sulfat 2 N, kloralhidrat, natrium hidroksida 2 N Depkes, 1979, Liebermann-Bouchard Harbone, 1987, Timbal II asetat 0,4 M Depkes, 1989.
3.3.1 Besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml 3.3.2
Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling, ditambahkan iodium sebanyak 2 g dan dicukupkan dengan air suling
hingga 100 ml.
3.3.3 Dragendorff
Sebanyak 0,85 g bismut III nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 100 ml asam asetat glasial ditambahkan 40 ml air suling. Kemudian pada wadah
lain ditimbang 8 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling, lalu campurkan kedua larutan sama banyak. Kemudian ditambahkan 20 ml asam asetat
glasial dan diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.
3.3.4 Mayer
Sebanyak 1,35 g raksa II klorida dilarutkan dalam 60 ml air suling. Kemudian pada wadah lain sebanyak 5 g kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml
Universitas Sumatera Utara
40
air lalu campurkan keduanya dan ditambahkan air suling hingga 100 ml. 3.3.5
Molish
Sebanyak 3 g alfa-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga volume 100 ml.
3.3.6 Asam Klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat dilarutkan dalam air suling hingga volume 100 ml.
3.3.7 Asam Sulfat 2 N
Sebanyak 5,4 ml asam sulfat pekat kemudian diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.
3.3.8 Natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml.
3.3.9 Kloralhidrat
Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan dalam 20 ml air.
3.3.10 Liebermann-Bouchard
Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 5 ml asam
sulfat pekat kemudian ditambahkan etanol hingga 50 ml 3.3.11
Timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air bebas karbondioksida hingga 100 ml.
3.4 Pengambilan dan Pengolahan Sampel 3.4.1 Pengambilan sampel
Universitas Sumatera Utara
41 Pengambilan sampel diambil dari perkebunan tanaman kecombrang dari
Pancur Batu. Sampel yang digunakan yaitu bunga kecombrang Nicolaia speciosa Horan. Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa
membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain.
3.4.2 Identifikasi sampel
Hasil identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI adalah
tumbuhan kecombrang Nicolaia speciosa Horan dari suku Zingiberaceae Liska, 2011. Hasil dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 24.
3.4.3 Pengolahan sampel
Bunga kecombrang sebanyak 10 kg, dicuci bersih dengan air mengalir, kemudian ditiriskan lalu disebarkan diatas kertas perkamen hingga airnya
terserap, lalu bunganya dipisahkan dari bongkolnya lalu dikeringkan di lemari pengering sampai bila diremas akan hancur, kemudian ditimbang sebagai berat
kering. Selanjutnya simplisia disimpan pada wadah ditempat yang terlindung dari sinar matahari.
3.5 Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia yang meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air.
3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik
dilakukan dengan mengamati sifat morfologi
luar, bau dan rasa simplisia bunga kecombrang.
Universitas Sumatera Utara
42
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik
dilakukan terhadap serbuk simplisia dan bunga
kecombrang segar. Serbuk simplisia ditaburkan sedikit diatas kaca objek, untuk bunga kecombrang segar dipotong secara melintang, kemudian masing-masing
ditambahkan kloralhidrat lalu dipanaskan dan tutup dengan kaca penutup, kemudian amati dibawah mikroskop. Gambar mikroskopik dapat dilihat pada
lampiran 4 halaman 27.
3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi Destilasi Toluen. Kedalam labu alas bulat di masukkan 200 ml toluen dan 2 ml air suling,
destilasi selama 2 jam, biarkan menjadi dingin selama 30 menit dan volume air dalam tabung penampung dibaca. Selanjutnya ke dalam labu dimasukkan 5 gram
serbuk simplisia lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur yaitu 2 tetesan per detik sampai sebagian air
terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena.
Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penampung dibiarkan dingin sampai sama dengan suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah
sempurna, dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air di dalam bahan yang diperiksa WHO,
1992.
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia dan ekstrak etanol bunga
Universitas Sumatera Utara
43 kecombrang meliputi pemeriksaan senyawa golongan flavonoid, tanin,
steroidatriterpenoida, dan minyak atsiri.
3.6.1 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 10 g sampel kemudian ditambahkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, filtrat yang
diperoleh kemudian diambil 5 ml lalu di tambahkan 0,1 g serbuk Mg dan 1 ml HCl pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok, dan dibiarkan memisah. Flavonoid
positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.6.2 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml
larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 ttes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.
3.6.3 Pemeriksaan SteroidaTriterpenoida
Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya ditambahkan 20
tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Liebermann- Bourchardad. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi
biru hijau menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Farnsworth, 1966.
3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Bunga Kecombrang Nicolaia speciosa
Horan Secara Maserasi
Sebanyak 750 g simplisia dimasukkan ke dalam wadah gelas berwarna gelap tuangi dengan 75 bagian cairan penyari etanol 80 tutup, biarkan selama
Universitas Sumatera Utara
44 5 hari dan terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, serkai, peras, cuci ampas
dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Pindahkan kedalam bejana tertutup, biarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2
hari. Enap tuangkan atau saring Depkes, 1979. Filtrat diuapkan menggunakan rotary evaporator pada temperatur ± 40°C sampai diperoleh ekstrak kental,
kemudian freeze dryer pada suhu - 40°C. Pembuatan ekstrak dapat dilihat pada lampiran 6 halaman 29.
3.8 Isolasi Minyak Atsiri
Isolasi minyak atsiri dilakukan dengan metode penyulingan air. Penyulingan dilakukan dengan menggunakan alat destilasi air terhadap serbuk
bunga kecombrang. Caranya : sebanyak 100 gram bunga kecombrang yang telah diserbukkan
dimasukkan ke dalam labu alas bulat berleher panjang 1 liter yang telah dirangkai dalam perangkat alat destilasi air. Destilasi dilakukan selama 4 jam. Destilat
ditampung dan dipisahkan bagian minyak atsirinya. Minyak atsiri yang diperoleh ditambahkan Na
2
SO
4
anhidrat dan didiamkan selama 12 jam. Minyak atsiri dipipet dan disimpan dalam botol berwarna coklat.
3.9 Sterilisasi Alat dan Bahan
Kategori