Jenis Penelitian Batasan Penelitian Metode Analisis Data

24

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan melakukan uji daya hambat ekstrak air cacing tanah Lumbricus rubellus terhadap pertumbuhan bakteri Salmonella thypi.

B. Batasan Penelitian

Agar penelitian ini lebih fokus dan terarah maka penulis membatasi masalah pada beberapa hal yang akan digunakan dalam penelitian ini yaitu: 1 Subyek penelitian: Bakteri Salmonella thypi yang didapatkan dari Balai Kesehatan Lingkungan Daerah Istimewa Yogyakarta. 2 Obyek penelitian: Cacing tanah Lumbricus rubellusyang didapat dari peternak cacing tanah, yaitu Bapak Sarjudi, di Jalan Godean Km 15 Ngijon Sleman Yogyakarta. 3 Melihat kemampuan daya hambat ekstrak cacing tanah Lumbricus rubellus terhadap bakteri Salmonella thypi menggunakan metode difusi Kirby-Bauer dengan konsentrasi ekstrak 10, 25, 50, 75, dan 100, serta kloramfenikol sebagai kontrol positif dan aquades steril sebagai kontrol negatif. 4 Variabel dalam penelitian ini adalah: a. Variabel bebas: Ekstrak cacing tanah Lumbricus rubellus b. Variabel terikat: Diameter zona hambat disekitar paper disc. c. Variabel kontrol: Media inkubasi, suhu inkubasi, waktu inkubasi, dan volume bakteri.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini sebagai berikut: Erlenmeyer Penjepit Gelas Beker Refrigerator Autoklaf Corong Gelas Tabung Reaksi Pipet Volume Kertas Saring Rak Tabung Reaksi Gelas Ukur Hot Plate Stirrer Magnetic Stirrer Vortex Mixer Pinset pH Meter Mistar Geser Gelas Benda Stamper Cawan Petri Gelas Penutup Jarum Inokulum Trigalski Mikroskop Binokuler Labu Ukur Inkubator Timbangan Analitik Pembakar Bunsen Kamera Mikro Kertas Payung Alumunium Foil Termometer Karet

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: a. Biakan murni Salmonella thypi yang diperoleh dari Balai Kesehatan Lingkungan Daerah Istimewa Yogyakarta b. Media Nutrien Agar NA c. Aquades steril d. Cat gram A cristal violet e. Cat gram B iodine f. Cat gram C alkohol g. Cat gram D safranin h. Alkohol i. Tinta cina j. Cacing tanah Lumbricus rubellus

D. Cara Kerja

Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan penelitian sebagai berikut: Persiapan Pendataan alat dan bahan Pelaksanaan Sterilisasi Alat dan Media, Pembuatan Ekstrak Cacing Lumbricus rubellus, Pembuatan Media Uji Nutrien Agar, Penyiapan Mikroorganisme Uji, Uji Kemurnian Mikroorganisme Uji. Perlakuan Uji Aktivitas Antibakteri, Kadar Hambat Minimal KHM dan uji Kadar Bunuh Minimal KBM. Berikut ini adalah tahapan yang dilakukan dalam penelitian:

1. Tahap Persiapan

Pada tahap persiapan peneliti terlebih dahulu melakukan inventaris alat dan bahan yang akan digunakan dalam penelitian. Cacing tanah Lumbricus rubellus yang digunakan sebagai sampel didapat dari peternak cacing tanah yaitu Bapak Sarjudi, di Jalan Godean Km 15 Ngijon Sleman Yogyakarta dalam kondisi yang baik untuk digunakan dalam penelitian. Mikroorganisme uji yang didapatkan dari Balai Kesehatan Lingkungan Daerah Istimewa Yogyakarta dilakukan kultur ulang terlebih dahulu untuk memperbanyak mikroorganisme uji. Langkah kerja yang dilakukan adalah menyiapkan media NA miring steril dalam tabung reaksi. Bakteri uji digoreskan secara zig-zag pada media NA miring steril. Hasil perbanyakan kultur bakteri dapat diamati setelah inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C Dwidjoseputro, 1998.

2. Tahap Pelaksanaan

a. Sterilisasi Alat dan Media Alat dan media yang digunakan dalam penelitian harus disterilisasi terlebih dahulu dengan tujuan memperkecil peluang kontaminasi. Sterilisasi yang dilakukan pada alat-alat berbahan kaca yaitu sterilisasi basah menggunakan autoklaf. Sterilisasi alat dilakukan pada tekanan 1 atm dan suhu 121 C selama 20 menit. Media NA yang akan digunakan harus dalam kondisi steril. Sterilisasi media NA sama seperti sterilisasi alat, namun waktu yang diperlukan hanya 10 menit. Sedangkan alat-alat yang tidak tahan panas dapat disterilisasi dengan pemberian alkohol atau pembakaran dengan api bunsen Jutono dkk, 1980. b. Pembuatan Ekstrak Cacing Tanah Lumbricus rubellus Cacing tanah disortir dipisahkan antara cacing tanah yang baik dan yang rusak dan dicuci bersih menggunakan air hingga tanah yang menempel di permukaan kulit cacing hilang. Cacing dalam kategori yang baik yaitu cacing tanah yang masih hidup dan yang rusak adalah yang mati. Ekstrak cacing tanah diperoleh dengan melakukan metode ekstraksi dimana sampel ditimbang sebanyak 17 gram dan dimasukkan dalam 17 ml aquades, kemudian direbus hingga mendidih. Setelah 30 detik mendidih kemudian ekstrak hasil rebusan diangkat dan didinginkan. Setelah dingin, ekstrak disaring sehingga mendapatkan stok ekstrak rebus 100 sebanyak 15 ml. Stok ekstrak 100 dapat diencerkan untuk mendapatkan konsentrasi masing- masing ekstrak sebesar 10, 25, 50, dan 75 menggunakan aquades steril. Menurut Yudha 2013 rumus pengenceran sebagai berikut : Keterangan : V 1 = volume larutan sebelumnya N 1 = konsentrasi larutan sebelumnya V 2 = volume larutan setelah pelarutan N 2 = konsentrasi larutan setelah pelarutan Ekstrak yang dibuat digunakan dalam uji daya hambat pertumbuhan bakteri. Variasi konsentrasi ekstrak pada tiap perlakuan dapat dilihat pada tabel 3.1 Tabel 3.1 Variasi Konsentrasi Ekstrak pada tiap perlakuan Variasi Konsentrasi Jumlah sampel ml Pelarut aquades ml 10 0,4 3,6 25 1 3 50 2 2 75 3 1 100 4 c. Pembuatan Media Uji Nutrien Agar NA Pembuatan media uji Nutrien Agar NA dapat dilakukan dengan mencampurkan NA Oxoid dengan aquades, perbandingan 10:500 yaitu untuk membuat NA sebanyak 100 ml maka memerlukan V 1 x N 1 = V 2 x N 2 Nutrien Agar Oxoid sebanyak 2 gram kemudian dipanaskan dengan Hot Plate Stirrer . Media NA dianggap sudah bisa diangkat apabila sudah berwarna jernih, kemudian sterilisasi media terlebih dahulu dengan autoklaf. Media NA pada cawan petri digunakan untuk menguji daya hambat pertumbuhan bakteri berisi masing-masing 10ml. Sedangkan pada agar miring untuk meremajakan bakteri biakan murni yang digunakan sebagai media kultur bakteri masing-masing 5 ml. d. Penyiapan Mikroorganisme Uji Mikroorganisme uji yang telah diperoleh dilakukan perbanyakan kultur murni. Kultur muri bakteri Salmonella thypi diambil sedikit menggunakan jarum ose, kemudian digoreskan di atas permukaan media NA miring secara aseptis. Setelah itu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C Jutono dkk, 1980. Dalam pengendalian mikroorganisme uji, bakteri yang akan digunakan dalam uji daya hambat pertumbuhan dilakukan pengenceran bertingkat terlebih dahulu. Satu ose biakan murni disuspensikan dengan 10 ml aquades steril pada tabung reaksi pertama. Tabung kedua berisi 9 ml aquades steril dan 1 ml suspensi yang diambil dari tabung pertama. Dilakukan dengan perlakuan yang sama hingga pengenceran 10 -6 . Suspensi bakteri pada pengenceran 10 - 6 diinokulasikan dalam media NA padat dengan metode spread plate. Sebanyak 0,2 ml suspensi bakteri diteteskan ke dalam cawan petri berisi media NA kemudian diratakan menggunakan trigalski Karenina, 2014. e. Uji Kemurnian Mikroorganisme Uji Mikroorganisme uji yang digunakan pada penelitian ini adalah Salmonella thypi . Langkah-langkah uji kemurniaan mikroorganisme uji, sebagai berikut: 1 Pengamatan Morfologi Koloni Diambil mikroorganisme uji sebanyak satu ose, kemudian diinokulasi secara goresan pada media NA dalam cawan petri. Kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Selanjutnya dilakukan pengamatan morfologi koloni mikroorganisme uji yang meliputi bentuk dan warna koloni Alexander, 2003. 2 Pengamatan Morfologi Sel Diambil mikroorganisme uji sebanyak satu ose, kemudian diinokulasi secara goresan pada media NA miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Pengamatan morfologi sel diamati dengan menggunakan pengecatan negatif. Berikut langkah kerjanya: gelas benda dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol, kemudian biakan mikroorganisme uji diambil secara aseptis sebanyak 1 ose dan diletakkan di atas gelas benda. Tinta cina diambil dan diteteskan pada salah satu ujung gelas benda, kemudian gelas benda yang lain diletakkan di atas suspensi dengn kemiringn 45 o lalu ditarik permukaannya dari ujung satu ke ujung lain hingga cat menjadi rata, sehingga menjadi lapisan tipis. Selanjutnya ditetesi dengan minyak emersi dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 100, kemudian dilakukan pengambilan gambar menggunakan kamera mikro Alexander, 2003. 3 Pengecatan Gram Tujuan pengecatan gram adalah untuk mengetahui sifat Gram mikroorganisme uji. Berikut langkah-langkah yang dilakukan: gelas benda dibersihkan dengan alkohol dan dipanaskan dengan lampu spiritus sampai kering. Selanjutnya menggunakan jarum ose diambil satu lup suspensi bakteri secara aseptis dan diratakan seluas ± 1 cm pada gelas benda, kemudian difiksasi dengan cara diletakkan di atas lampu bunsen yang menyala. Objek yang sudah difiksasi selanjutnya ditetesi cat Gram A kristal volet pada permukaan lapisan bakteri dan didiamkan selama 1 menit. Hasil pengecatan Gram A dicuci dengan air mengalir selama 5 detik kemudian dikeringkan. Setelah kering, cat Gram B iodine diteteskan dan didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir selama 5 detik dan keringkan. Selanjutnya objek diberi cat Gram C alkohol dan didiamkan selama 30 detik. Setelah itu dicuci dengan air mengalir selama 5 detik dan keringkan. Setelah kering, objek ditetesi dengan cat Gram D safranin dan didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Hasil ditutup dengan gelas penutup dan ditetesi dengan minyak imersi kemudian diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 100, kemudian dilakukan pengambilan gambar menggunakan kamera mikro. Jika sel berwarna biru, berarti bakteri tersebut bersifat Gram-positif dan jika sel berwarna merah, berarti bakteri tersebut bersifat Gram-negatif Alexander, 2003.

3. Tahap Perlakuan

a. Uji Pendahuluan Uji pendahuluan dilakukan dengan menggunakan metode cakram kertas steril dengan diameter 0,5 cm dicelupkan dalam variasi konsentrasi ekstrak selama 1 malam, kemudian diletakkan pada media yang berisi bakteri uji. Perlakuan variasi konsentrasi yaitu sebesar 10, 20, 30 dan 40 masing-masing dibuat pengulangan sebanyak 4 kali serta kloramfenikol sebagai kontrol positif dan aquades steril sebagai kontrol negatif. Media diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Uji pendahuluan ini dilakukan untuk menentukan konsentrasi pada uji aktivitas anti bakteri. b. Uji Aktivitas Bakteri Uji aktivitas antibakteri pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode cakram kertas. Cakram kertas steril dengan diameter 0,5 cm dicelupkan dalam variasi konsentrasi ekstrak selama 1 malam, kemudian diletakkan pada media yang berisi bakteri uji. Perlakuan variasi konsentrasi yaitu sebesar 10, 25, 50, 75 dan 100 masing-masing dibuat pengulangan sebanyak 4 kali serta kloramfenikol sebagai kontrol positif dan aquades steril sebagai kontrol negatif. Media diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Keefektifan ekstrak cacing tanah sebagai antibakteri diamati dengan memperhatikan zona bening yang terbentuk sekitar kertas cakram. Daerah hambat biasanya tempak lebih bening daripada daerah sekitarnya. Daerah hambat diukur dengan menggunakan penggaris. c. Uji Kadar Hambat Minimal KHM Variasi konsentrasi ekstrak cacing tanah yang akan diuji yaitu 5, 6, 7, 8, 9, dan 10 pada percobaan pertama, sedangkan pada percobaan kedua dengan variasi konsentrasi 5, 10, 15, 20, 25, 30, dan 35 . Metode yang digunakan dalam pengujian yaitu metode ilusi padat. Pada metode ini dilakukan penanaman bakteri secara pourplate. Langkah kerjanya sebagai berikut: media NA yang telah disterilisasi dengan suhu 45 C dituangkan sebanyak 10 ml ke dalam cawan petri yang berisi 0,5 ml mikroorganisme uji dan 0,5 ml sampel ekstrak. Mikroorganisme uji pada pengenceran 10 -6 di vortex sebelum digunakan dan media NA didinginkan terlebih dahulu setelah disterilisasi pada suhu 45 C. Hasil pourplate diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37 C. Penentuan nilai KHM dilihat dari konsentrasi terendah pada media yang tidak ditumbuhi bakteri. d. Uji Kadar Bunuh Minimal KBM Setelah diperoleh hasil dari uji KHM dilanjutkan dengan uji Kadar Bunuh Minimal KBM menggunakan metode streak plate. Langkah kerjanya yaitu dengan menggoreskan hasil yang ditetapkan sebgai KHM menggunkan cotton bud steril pada media NA steril tanpa menambah bakteri uji ataupun senyawa antibakteri. Selanjutnya kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Media kultur NA yang tetap terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai Kadar Bunuh Minimal KBM.

E. Metode Analisis Data

Data mengenai daya hambat ekstrak cacing Lumbricus rubellus terhadap pertumbuhan bakteri Salmonella typhi yang diperoleh setelah pengamatan dilanjutkan dengan pengujian statistik. Uji yang digunakan adalah ujiOne Way Anova dengan tingkat kepercayaan 95. Digunakan confident interval 0,95 atau α = 0,05. Bila probabilitas p lebih kecil dari α, maka significant. Perhitungan dilakukan dengan program SPSS versi 17,0. Pengujian statistik ini bertujuan untuk mengetahui perlakuan yang sungguh memberikan pengaruh secara signifikan. 36

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Identifikasi Cacing Tanah Lumbricus rubellus

Cacing tanah yang digunakan oleh peneliti adalah cacing Lumbricus rubellus yangmemiliki ciri-ciri sebagai berikut: seluruh tubuh tersusun atas segmen-segmen yang berbentuk cincin dan tidak memiliki kerangka luar, pada tubuhnya terdapat lendir, bentuk tubuh bagian atas dorsal membulat dan bagian bawah ventral pipih, ukuran tubuh relatif kecil dengan panjang 4 – 7 cm, bagian akhir tubuhnya terdapat anus untuk mengeluarkan sisa-sisa makanan dan tanah yang dimakannya, warna tubuh terutama bagian punggung berwarna cokelat cerah sampai kemerahan, perut berwarna krem dan ekor berwarna kekuningan. Tubuh semi transparan dan elastis, tidak memiliki alat gerak dan tidak memiliki mata. Ciri-ciri cacing tanah Lumbricus rubellus yang diperoleh dari peternak cacing yaitu Bapak Sarjudi, di Jalan Godean Km 15 Ngijon Sleman Yogyakarta yang digunakan dalam penelitian sesuai dengan kunci determinasi Biologi Tanah: Ekologi Makrobiologi tanah Kemas, 2005.