akan terjadi apabila pelarut menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang berisi zat aktif yang dapat larut dalam pelarut. Zat aktif dapat keluar dari
rongga sel karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam dan di luar sel.
C. Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian disterilkan terlebih dahulu untuk menghilangkan adanya pengotor dan mencegah terjadinya kontaminasi
oleh mikroorganisme yang akan mengganggu proses penelitian Alat-alat tersebut dicuci bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan alumunium foil
kemudian disterilisasi dilakukan selama kurang lebih 20 menit dengan suhu 121
C, tekanan 2,05 abs bar, menggunakan alat autoklaf. Prinsip sterilisasi yang digunakan ialah sterilisasi dengan uap bertekanan yaitu dengan menaikkan
tekanan hingga suhu tinggi sehingga terbentuk uap air panas. Uap air panas tersebut akan membunuh mikroorganisme dengan menyebabkan terjadinya proses
koagulasi dan denaturasi protein pada mikroorganisme. Medium dan pereaksi yang akan digunakan juga disterilkan dengan
menggunakan membran filter dengan pori-pori berukuran 0,22 μm. Pengotor dan
kontaminan yang kemungkinan ada akan tersaring dan tertahan pada membran filter ini, sehingga medium dan pereaksi benar-benar bebas dari kontaminasi.
D. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah Terhadap Sel HeLa
Uji sitotoksisitas yang dilakukan pada awalnya adalah dengan menggunakan metode MTT. Prinsip uji sitotoksik dengan metode MTT adalah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kemampuan sel hidup mereduksi garam MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5- diphenyl tetrazolium bromide menjadi kristal formazan. Kemampuan reduksi ini
ditunjukkan oleh enzim suksinat dehidrogenase mitokondria pada sel yang viablesel hidup yang masih melangsungkan proses respirasi.
Reaksi reduksi MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase ditunjukkan dengan gambar berikut
Gambar 1. Reaksi reduksi MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase
Senyawa MTT yang larut dalam air dan berwarna kuning setelah direduksi oleh suksinat dehidrogenase akan menjadi formazan yang berwarna biru.
Intensitas warna yang terbentuk kemudian ditetapkan absorbansinya dengan pembacaan ELISA reader. Absorbansi yang terbaca ini berkorelasi
langsung dengan jumlah sel yang hidup. Semakin besar absorbansi berarti semakin banyak sel hidup yang aktif melakukan metabolisme dan sebaliknya,
semakin kecil absorbansi yang terbaca menunjukkan semakin sedikit sel yang hidup. Metode ini dipilih dengan pertimbangan bahwa metode ini cukup baik,
mudah, cepat, akurat, tidak menggunakan bahan radioaktif, dan sensitif karena mampu menghitung jumlah sel yang sedikit.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Namun pada penelitian, ternyata ELISA reader tidak mampu membaca dengan tepat intensitas warna ungu formazan yang terbentuk akibat reaksi MTT
dengan sel. Hal ini kemungkinan disebabkan karena ekstrak etanolik daun sirih merah yang digunakan sebagai senyawa uji memiliki warna coklat. Warna coklat
ini dapat berpengaruh pada nilai absorbansi yang dihasilkan karena dimungkinkan terjadi penambahan intensitas warna sehingga absorbansi yang terbaca dapat
menjadi lebih besar daripada nilai yang sebenarnya. Pada penelitian ini dilakukan pengukuran absorbansi dari perlakuan dan
kontrol pada masing-masing konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah. Perlakuan adalah sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etanolik daun sirih merah.
dan kontrol adalah sel HeLa tanpa ada perlakuan. Hasil yang diperoleh antara pembacaan absorbansi dengan ELISA reader
ternyata tidak signifikan dengan hasil gambar sel. ELISA reader memberikan absorbansi yang rendah namun pada foto terlihat bahwa sel HeLa pada semua seri
konsentrasi justru masih hidup. Padahal seharusnya apabila sel banyak yang hidup maka absorbansi yang diberikannya adalah tinggi.
Metode uji sitotoksisitas lain dapat dilakukan untuk mengatasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang berwarna coklat ini seperti metode Tripan Blue
yang tidak dipengaruhi oleh warna dari ekstrak Pada metode ini, penghitungan dilakukan secara manual terhadap sel hidup setelah sebelumnya sel diwarnai
dengan reagen Tripan Blue. Sel yang mati akan menyerap reagen sehingga warnanya lebih gelap daripada sel hidup dan ekstrak yang berwarna tidak akan
terlalu berpengaruh pada penghitungan sel.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Nilai absorbansi hasil uji sitotoksisitas dengan metode MTT pada inkubasi selama 24 jam dapat dilihat pada tabel berikut:
Tabel I. Tabel Nilai Absorbansi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah pada Berbagai Konsentrasi dengan Metode MTT
Replikasi I II III
Konsentrasi µgml
Absorbansi Absorbansi Absorbansi Kontrol 1,394 1,293 1,289
32000 0,798 0,875 0,821 16.000 0,679 0,679 0,681
8000 0,734 0,731 0,713 4000 0,778 0,727 0,735
2000 1,119 1,037 0,724 1000 0,973 0,921 0,923
500 1,329 1,367 1,315 250 1,655 1,674 1,513
125 1,496 1,530 1,440
Dari hasil uji sitotoksisitas dengan metode MTT didapatkan data absorbansi sampel yang lebih besar daripada absorbansi kontrol, dimana
seharusnya absorbansi sampel lebih kecil daripada absorbansi kontrol. Hal itu disebabkan karena ekstrak etanolik daun sirih merah yang digunakan berwarna
sehingga juga memberikan absorbansi dan menyebabkan absorbansi sampel meningkat. Oleh karena itu,maka selanjutnya uji sitotoksisitas dilakukan dengan
menggunakan metode penghitungan langsung direct counting Metode yang digunakan untuk menguji sitotoksisitas ekstrak etanolik
daun sirih merah adalah metode penghitungan langsung direct counting. Pada prinsipnya, sel yang masih hidup setelah pemaparan dengan senyawa uji dihitung
secara langsung menggunakan mikroskop dengan bantuan haemocytometer. Untuk membedakan sel yang hidup dan mati digunakan Tripan blue sebagai
pewarna. Sel yang mati akan berwarna biru tua karena menyerap Tripan blue
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
sedangkan sel yang hidup tetap bening dan bercahaya. Hal ini terjadi karena sel yang mati kehilangan integritas membrannya sehingga Tripan blue dapat masuk
ke dalam sel dan berikatan dengan protein-protein sel. Sel yang hidup tampak bulat,bening dan bercahaya karena membran sel masih utuh sehingga Tripan blue
tidak dapat berikatan dengan protein-protein sel. Sel yang masih hidup tampak bercahaya karena sitoplasmanya masih utuh.
Kelemahan dari metode penghitungan langsung adalah subyektivitasnya yang tinggi dan membutuhkan waktu penghitungan yang lama. Untuk mengurangi
subyektivitas, penghitungan diulang minimal 3 kali dan pengamatan bentuk sel yang hidup dan mati harus konsisten. Pemaparan sel dengan Tripan blue yang
terlalu lama dapat menyebabkan sel yang hidup juga menyerap Tripan blue dan lama – kelamaan sel dapat mati karena Tripan blue. Untuk mengatasi hal ini maka
penambahan Tripan blue ke dalam sumuran tidak dilakukan secara serempak namun satu persatu tiap sumuran ditambah Tripan blue, dihomogenkan kemudian
langsung dibaca. Media yang digunakan banyak mengandung protein dimana dimana protein-protein serum dalm media juga memiliki afinitas terhadap Tripan
blue. Hal ini juga dapat mempengaruhi pengamatan karena akan mempengaruhi bidang pandang, yaitu saat pengamatan akan terlihat gelap dan kotor sehingga
menyulitkan pengamatan sel hidup. Penghitungan secara langsung membutuhkan waktu yang cukup lama. Hal ini dapat berpengaruh pda stabilitas sel karena sel
berada di suhu penyimpanan dengan suhu dan aliran CO2 yang berbeda.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
E. Analisis Hasil
