D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun sirih merah segar, telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Biologi Farmasi
Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan merujuk acuan baku.
2. Pengumpulan dan penyiapan bahan
Bahan yang digunakan berupa daun sirih merah, diambil dari tanaman sirih merah di Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang,
Jawa Tengah. Daun tersebut dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan sampai sisa-sisa air
menghilang. Daun kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 60 ˚-65˚C.
Setelah kering, lalu diserbuk dengan blender sampai halus dan diayak dengan ayakan 0,75 mm.
3 . Ekstraksi
Serbuk simplisia diekstrak secara maserasi memakai etanol 70. Untuk tiap 100 gram serbuk digunakan 700 ml etanol 70. Maserasi yang digunakan
adalah secara remaserasi, yakni dengan menambahkan 100 gram serbuk simplisia dengan 500 ml etanol 70 dalam erlenmeyer, kemudian ditutup dan dibiarkan
selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari untuk mencegah reaksi yang dikatalisis oleh cahaya atau perubahan warna. Setelah 24 jam sari diserkai,
disaring, ampas diperas. Ampas yang diperoleh kemudian ditambah cairan penyari sebanyak 200 ml, diaduk dan diserkai. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk,
terlindung dari cahaya, selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Rendaman
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
harus dikocok berulang-ulang kira-kira 3 x sehari. Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring, kemudian ditampung. Maserat yang terkumpul
kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-65
o
C, dibantu dengan kipas angin sampai kental.
4. Sterilisasi alat dan bahan
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat
tersebut dicuci bersih dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 121
C dan tekanan 2,05 abs bar Hagman, 2005.
5. Uji sitotoksisitas ekstrak daun sirih pada sel HeLa a. Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl ekstrak etanolik daun sirih
merah dengan kadar 1000 µgml, 1250 µgml, 1500 µgml, 1750 µgml, dan 2000 µgml dimasukkan ke dalam 100
μl suspensi sel HeLa dengan kepadatan 2x10
4
100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang berbeda.
Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well
plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37
o
C, dalam inkubator dengan aliran 5 CO
2.
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 5 μgml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu
37
o
C, dalam inkubator dengan aliran CO
2
5. Sel hidup akan bereaksi dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar.
Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.
b. Uji Sitotosisitas dengan Metode Direct Counting
Sel dengan kepadatan 2 x 10
4
sel 100 μl media diinkubasikan dalam
sumuran bersama dengan ekstrak uji sesuai dengan seri kadar yang dibuat yaitu 1000
μg ml, 1250 μg ml, 1500 μg ml, 1750 μg ml, 2000 μg ml serta media RPMI 1640 dan sel sebagai kontrol. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu
37
o
C dan dialiri 5 CO2. Pada akhir masa inkubasi, tiap sumuran sel diresuspensi, dimasukkan dalam haemocytometer kemudian dihitung jumlah sel
nya dengan metode pewarnaan biru tripan dan dibaca di bawah mikroskop.
6. Analisis Hasil a. Metode
Kategori