diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer
. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,0x10
4
sel100 µl dan siap dipakai untuk penelitian lebih lanjut Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.
7. Pembuatan larutan uji
Ekstrak kental ditimbang, dilarutkan dengan pelarut DMSO dan diaduk dengan homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan konsentrasi 100
mgml. Sebelum digunakan sediaan ekstrak disterilkan dengan filter membran. Dari sediaan steril ekstrak induk tersebut dibuat sediaan uji dengan konsentrasi ekstrak
etanolik daun sirih merah 125 µgml; 250 µgml; 500 µgml; 750 µgml; dan 1000 µgml.
8. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah
a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel SiHa dengan
kepadatan 2x10
4
100 µ l dimasukkan ke dalam sumuran 96 well plate yang telah berisi 100 µl ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar 1000 µgml pada sumuran A
1
, B
1
dan C
1
pada kolom 1, kemudian pada sumuran A
2
, B
2
dan C
2
di kolom 2 ditambahkan 100 µl suspensi sel SiHa pada sumuran yang telah berisi 100 µl ekstrak
daun sirih dengan kadar 750 µgml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Untuk kontrol digunakan 100 µl
suspensi sel SiHa dalam media penumbuh. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
selama 24 jam pada suhu 37
o
C, dalam inkubator dengan aliran 5 CO
2
Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing- masing sumuran ditambahkan 10 µl MTT 5 µgml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37
o
C, dalam inkubator dengan aliran CO
2
5. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 µl reagen
stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap
sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.
b. Uji Sitotoksisitas dengan Metode Direct Counting Seratus µl suspensi sel SiHa dengan kepadatan 2,0x10
4
sel 100 µl dimasukkan ke dalam sumuran pada 96-well plate, ditambah ekstrak uji pada kadar
masing- masing 125 µgml; 250 µgml; 500 µgml; 750 µgml; dan 1000 µgml. Untuk kontrol digunakan 100 µl suspensi sel SiHa dalam media penumbuh. Selanjutnya
plate diinkubasi dalam inkubator dengan aliran 5 CO
2
selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Pada akhir masa inkubasi tiap sumuran diresuspensi, ditambah 50 µl Trypan blue
, diresuspensi lagi untuk homogenisasi diambil 10 µl untuk pengamatan. Ditempatkan dalam haemocytometer, sel siap dihitung dengan counter dibawah
mikroskop.
9. Analisis hasil
