Rancangan Penelitian Kerangka Operasional Instrumen Penelitian Analisa Data

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di Sentra Diagnostik Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU Medan.

3.1.2. Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan mulai dari Januari 2012 sampai Juli 2012 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan sampel, pengolahan data penelitian serta penulisan tesis.

3.2. Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan specimen jaringan kista ovarium yang telah didiagnosis sebelumnya menggunakan mikroskop cahaya dengan pewarnaan rutin HE Hematoksilin dan Eosin, berupa kista endometriosis dan kista berdarah lainnya terutama kista lutein berdarah. Jaringan-jaringan tersebut kemudian dievaluasi secara imunohistokimia untuk melihat tampilanekspresi CD10. Rancangan penelitian ini akan menggunakan metode observasional dengan pendekatan cross sectional. Dalam penelitian ini, tidak diberikan perlakuan terhadap variabel, namun hanya dilihat hasil pulasan imunohistokimia CD 10. Pengukuran variabelnya hanya dilakukan satu kali dan pada satu saat. Universitas Sumatera Utara

3.3. Kerangka Operasional

Kriteria eksklusi Kista endometriosis Kista lutein berdarah Blok paraffin kista coklat ovarium Immunohistokimia CD 10 Pemeriksaan histopatologi konvensional HE CD 10 + CD 10 - Kista endometriosis Kista lutein berdarah Universitas Sumatera Utara 3.4. Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.4.1. Populasi Populasi dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin yang berasal dari jaringan kista ovarium yang didiagnosa sebagai kista lutein berdarah dan kista endometriosis pada Sentra diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU dan Laboratorium swasta di Medan.

3.4.2. Sampel

Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari jaringan kista ovarium berupa endometriosis dan kista lutein berdarah yang sesuai dengan kriteria inklusi dan sesuai besar sampel penelitian.

3.4.3. Besar Sampel Penelitian

Perkiraan besarnya sampel penelitian berdasarkan perhitungan dengan menggunakan rumus uji hipotesis terhadap 2 proporsi : Keterangan : n = besar sampel  n 1 = n 2 Zα = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya tergantung pada nilai α yang ditentukan untuk α = 0,05  Zα = 1,96 Zα√2PQ + Zβ√P 1 Q 1 +P 2 Q 2 2 P1-P2 2 n = Universitas Sumatera Utara Z β = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya tergantung pada nilai β yang ditentukan untuk β = 0,10  Zβ = 1,282 P 1 = proporsi penderita kista endometriosis = 0,695  menurut salah satu studi, angka kejadian endometriosis di RSCM = 69,5 kepustakaan no.1 Q 1 = 1- P 1 = 1 – 0,695 = 0,305 P 2 = proporsi penderita kista lutein berdarah yang diharapkan dalam penelitian ini = 0,495 Q 2 = 1- P 2 = 1 - 0,495 = 0,505 P = ½ P 1 +P 2 = ½ 0,695 + 0,495 = 0,545 Q = 1- P = 1 – 0,545 = 0,455 Hasil perhitungan : n = [ 1,96√20,5450,455 + 1,282√0,6950,305+0,4950,505 ] 2 0,50 2 = 0,9714 + 0,8589 2 0,30 2 = 37,22 ≈ 38 Jadi dibutuhkan sampel minimal untuk masing-masing kelompok pemeriksaan histopatologi dan pemeriksaan imunohistokimia CD 10 kista ovarium masing-masing adalah 38. Dalam penelitian ini, setengah jumlah sampel minimal diambil dari kelompok kista endometriosis dan setengah lagi dari kelompok kista lutein berdarah. Universitas Sumatera Utara Kemudian untuk kelompok ke-2 yaitu untuk pemeriksaan IHK CD 10, sampel minimal juga 38 kasus. 3.5. Kriteria Inklusi dan Kriteria Eksklusi 3.5.1. Kriteria Inklusi Yang termasuk kriteria inklusi adalah sediaan blok parafin jaringan kista lutein berdarah dan kista endometriosis dan slide pulasan Hematoksilin-Eosin nya.

3.5.2. Kriteria Eksklusi

 Sediaan blok parafin jaringan kista jenis lain seperti kista adenoma, kista ganas, kista folikel, kista sex cord, kista germ cell, kista metastase.  Sediaan blok parafin yang rusak dan tidak dapat diproses lebih lanjut dengan pulasan imunohistokimia CD 10. 3.6. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 3.6.1. Variabel Penelitian Variabel yang menjadi perhatian di dalam penelitian ini adalah :  Variabel bebas berupa tampilan immunohistokimia CD 10, dan  Variabel terikat berupa lesi kista endometriosis dan kista lutein berdarah. Universitas Sumatera Utara

3.6.2. Definisi Operasional

 Kista endometriosis adalah kista ovarium yang mengandung sel- sel endometrium ektopik baik epitel kelenjar maupun sel stromanya.  Kista lutein berdarah adalah kista ovarium yang mengandung banyak massa perdarahan yang mirip dengan kista endometriosis.  Pemeriksaan histopatologi konvensional adalah pemeriksaan jaringan menggunakan mikroskop cahaya terhadap specimen yang telah melalui prosesing sampai diwarnai dengan hematoksilin- eosin.  CD 10 adalah antibodi yang mampu mewarnai sel-sel stroma endometrium menjadi coklat.  Hasil pulasan immunohistokimia CD 10 adalah tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel stroma yang dinyatakan dengan :  Negatif, bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana pada saat proses yang sama kontrol + menampilkan warna coklat dengan pewarnaan kromogen DAB.  Positif, bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel stroma dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 100X dan 400x pada seluruh lapangan pandang dan pada saat yang sama kontrol + juga menampilkan warna yang sama. Universitas Sumatera Utara 3.7. Prosedur dan Teknik Penelitian 3.7.1. Pembuatan sediaan mikroskopis Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut : 1. Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer sampai cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4 µm. Setiap blok parafin, dipotong ulang 1 kali untuk pulasan imunohistokimia CD 10. 2. Sampel blok parafin yang sudah dipotong tipis 4 µm ditempelkan pada kaca objek. Pada pulasan imunohistokimia CD 10 digunakan kaca objek yang telah di-coating dengan poly-L-lysine atau Silanized slide agar jaringan dapat menempel pada kaca objek selama proses pulasan imunohistokimia. Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek silanized adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing. Potongan tipis dipisahkan dan diratakan dengan memasukkannya ke dalam air hangat. Setelah mengembang, pindahkan ke atas kaca objek. Selanjutnya, kaca objek diletakkan di atas alat pemanas hot plate. Setelah parafin melunak, kaca objek dikeringkan dan potongan jaringan siap untuk dipulas. Universitas Sumatera Utara

3.7.2. Prosedur kerja

 Deparafinisasi dengan xylol I, II masing-masing 5 menit.  Rehidrasi Alkohol absolute, Alk 96, Alk 80, Alk 70 masing- masing 5 menit.  Cuci dengan air mengalir.  Masukkan slide ke dalam PT Link Dako Epitope Retrieval : set up Preheat 65°C, Running time 98°C selama 15 menit.  Pap Pen. Segera masukkan dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4.  Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4  Blocking dengan Normal horse Serum NHS 3 .  Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4.  Inkubasi dengan Antibodi Primer sesuai kasus yaitu CD 10 Ready to Use.  Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 Tween 20  Dako Real Envision RabbitMouse.  Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 Tween 20.  DAB+Substrat Chromogen solution dengan pengenceran 20 µL DAB : 1000 µL substrat.  Cuci dengan air mengalir.  Counterstain dengan Hematoxylin.  Cuci dengan air mengalir.  Lithium carbonat 5 dlm aqua 3 celup.  Cuci dengan air mengalir. Universitas Sumatera Utara  Dehidrasi Alk 80, Alk 96, Alk Abs.  Clearing Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3.  Mounting dengan entellan + cover glass. 3.8. Alat dan Bahan Penelitian 3.8.1. Alat-Alat Penelitian Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah : mikrotom, waterbath, hot plate, freezer, inkubator, staining jar, rak kaca objek, kaca objek, rak inkubasi, pensil Diamond, pipet mikro, timbangan bahan kimia, kertas saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung sentrifuge, Dako PT Link Heat mediated Antigen Retrieval Method, thermolyte stirrer, kaca penutup, entelan dan mikroskop cahaya.

3.8.2. Bahan Penelitian

 Blok parafin yang telah didiagnosis dengan pulasan Hematoksilin Eosin sebagai kista endometriosis ovarium dan kista lutein berdarah.  Antibodi primer yang digunakan adalah Rabbit Polyclonal Hu- antibody CD 10 Ready to Use.  Pulasan imunohistokimia menggunakan metode The EnVision+ Dual Link System kit yang terdiri dari : Universitas Sumatera Utara  1 botol Dual endogenous enzyme block 15 ml  1 botol Labelled polymer-HRP 15 ml  1 botol DAB+ Substrat Buffer 18 ml  1 botol DAB+ Chromogen 1 ml  Larutan TBS  Larutan Tris EDTA  Xylol, Alkohol  Lithium carbonat  Hematoksilin  Mounting media : entellan

3.9. Instrumen Penelitian

Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pulasan imunohistokimia CD 10 terhadap sampel sediaan jaringan kista ovarium. Untuk penilaian terhadap pulasan imunohistokimia CD 10 adalah sebagai berikut :  Kontrol positif : jaringan limfe nodi.  Kontrol negatif : kista ovarium dengan antibodi primer yang digantikan dengan serum normal.  Positif : warna coklat yang tertampil pada sitoplasma sel-sel stroma pada kista. Universitas Sumatera Utara Tabel 3.1. Intensitas tampilan imunohistokimia CD 10 pada kista endometriosis dan kista lutein berdarah. INTENSITAS IHK CD 10 Kista endometriosis Kista lutein berdarah JUMLAH NEGATIF POSITIF JUMLAH Keterangan : Intensitas tampilan CD 10 : Negatif : tidak tertampil Positif : tertampil warna coklat pada sel stroma.

3.10. Analisa Data

 Untuk melihat gambaran karakteristik kista coklat ovarium berupa kista endometriosis dan kista lutein berdarah, disajikan dalam bentuk tabulasi dan dideskripsikan.  Untuk menganalisa perbedaan hasil pulasan hematoksilin-eosin konvensional terhadap tampilan imunohistokimia CD 10 menggunakan uji Chi-square. Universitas Sumatera Utara

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil penelitian

Pemeriksaan imunohistokimia CD 10 dilakukan terhadap 44 sediaan blok paraffin jaringan histopatologi kista ovarium yang sebelumnya didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin sebagai kista endometriosis dan kista lutein berdarah. Berdasarkan umur, distribusi sampel yang dimasukkan dalam penelitian ini tertampil pada tabel 4.1. Tabel 4.1. Distribusi umur dari seluruh sampel kista ovarium yang digunakan dalam penelitian. Umur n 20 tahun 2 4,5 20-35 tahun 30 68,2 35 tahun 12 27,3 Total 44 100,0 Mean = 32,50 SD = 7,407 Minimum = 18 Maksimum = 49 Dari data distribusi yang digambarkan pada tabel 4.1., umur penderita kista ovarium berupa endometriosis dan kista lutein berdarah yang paling banyak adalah kelompok usia reproduktif yaitu umur 20-35 tahun, dengan jumlah sampel sebanyak 30 kasus 68,2. Dan sampel yang minimal adalah yang termasuk pada kelompok umur kurang dari 20 tahun, berjumlah 2 orang 4,5. Universitas Sumatera Utara