BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Sentra Diagnostik Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU Medan.
3.1.2. Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai dari Januari 2012 sampai Juli 2012 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan
sampel, pengolahan data penelitian serta penulisan tesis.
3.2. Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan specimen jaringan kista ovarium yang telah didiagnosis sebelumnya menggunakan mikroskop cahaya dengan
pewarnaan rutin HE Hematoksilin dan Eosin, berupa kista endometriosis dan kista berdarah lainnya terutama kista lutein berdarah.
Jaringan-jaringan tersebut kemudian dievaluasi secara imunohistokimia untuk melihat tampilanekspresi CD10. Rancangan penelitian ini akan
menggunakan metode observasional dengan pendekatan cross sectional. Dalam penelitian ini, tidak diberikan perlakuan terhadap
variabel, namun hanya dilihat hasil pulasan imunohistokimia CD 10. Pengukuran variabelnya hanya dilakukan satu kali dan pada satu saat.
Universitas Sumatera Utara
3.3. Kerangka Operasional
Kriteria eksklusi
Kista endometriosis
Kista lutein berdarah
Blok paraffin kista coklat ovarium
Immunohistokimia CD 10 Pemeriksaan histopatologi konvensional HE
CD 10 + CD 10 -
Kista endometriosis
Kista lutein berdarah
Universitas Sumatera Utara
3.4. Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.4.1. Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin yang berasal dari jaringan kista ovarium yang didiagnosa sebagai kista
lutein berdarah dan kista endometriosis pada Sentra diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU dan Laboratorium
swasta di Medan.
3.4.2. Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari jaringan kista ovarium berupa endometriosis dan kista lutein
berdarah yang sesuai dengan kriteria inklusi dan sesuai besar sampel penelitian.
3.4.3. Besar Sampel Penelitian
Perkiraan besarnya sampel penelitian berdasarkan perhitungan dengan menggunakan rumus uji hipotesis terhadap 2 proporsi :
Keterangan :
n = besar sampel n
1
= n
2
Zα = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya tergantung pada nilai
α yang ditentukan untuk α = 0,05 Zα = 1,96 Zα√2PQ + Zβ√P
1
Q
1
+P
2
Q
2 2
P1-P2
2
n =
Universitas Sumatera Utara
Z β = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya tergantung pada
nilai β yang ditentukan untuk β = 0,10 Zβ = 1,282
P
1
= proporsi penderita kista endometriosis = 0,695 menurut salah satu studi, angka kejadian endometriosis di
RSCM = 69,5 kepustakaan no.1 Q
1
= 1- P
1
= 1 – 0,695 = 0,305
P
2
= proporsi penderita kista lutein berdarah yang diharapkan dalam penelitian ini = 0,495
Q
2
= 1- P
2
= 1 - 0,495 = 0,505 P = ½ P
1
+P
2
= ½ 0,695 + 0,495 = 0,545 Q = 1- P = 1
– 0,545 = 0,455
Hasil perhitungan : n = [ 1,96√20,5450,455 + 1,282√0,6950,305+0,4950,505 ]
2
0,50
2
= 0,9714 + 0,8589
2
0,30
2
= 37,22 ≈ 38
Jadi dibutuhkan sampel minimal untuk masing-masing kelompok pemeriksaan histopatologi dan pemeriksaan imunohistokimia CD 10
kista ovarium masing-masing adalah 38.
Dalam penelitian ini, setengah jumlah sampel minimal diambil dari kelompok kista endometriosis dan setengah lagi dari kelompok kista
lutein berdarah.
Universitas Sumatera Utara
Kemudian untuk kelompok ke-2 yaitu untuk pemeriksaan IHK CD 10, sampel minimal juga 38 kasus.
3.5. Kriteria Inklusi dan Kriteria Eksklusi 3.5.1. Kriteria Inklusi
Yang termasuk kriteria inklusi adalah sediaan blok parafin jaringan kista lutein berdarah dan kista endometriosis dan slide pulasan
Hematoksilin-Eosin nya.
3.5.2. Kriteria Eksklusi
Sediaan blok parafin jaringan kista jenis lain seperti kista adenoma, kista ganas, kista folikel, kista sex cord, kista germ cell, kista
metastase. Sediaan blok parafin yang rusak dan tidak dapat diproses lebih
lanjut dengan pulasan imunohistokimia CD 10.
3.6. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 3.6.1. Variabel Penelitian
Variabel yang menjadi perhatian di dalam penelitian ini adalah : Variabel bebas berupa tampilan immunohistokimia CD 10,
dan Variabel terikat berupa lesi kista endometriosis dan kista
lutein berdarah.
Universitas Sumatera Utara
3.6.2. Definisi Operasional
Kista endometriosis adalah kista ovarium yang mengandung sel- sel endometrium ektopik baik epitel kelenjar maupun sel
stromanya. Kista lutein berdarah adalah kista ovarium yang mengandung
banyak massa perdarahan yang mirip dengan kista endometriosis. Pemeriksaan histopatologi konvensional adalah pemeriksaan
jaringan menggunakan mikroskop cahaya terhadap specimen yang telah melalui prosesing sampai diwarnai dengan hematoksilin-
eosin. CD 10 adalah antibodi yang mampu mewarnai sel-sel stroma
endometrium menjadi coklat. Hasil pulasan immunohistokimia CD 10 adalah tampilan pulasan
warna coklat pada sitoplasma sel stroma yang dinyatakan dengan : Negatif, bila tidak berhasil menampilkan warna coklat,
dimana pada saat proses yang sama kontrol + menampilkan warna coklat dengan pewarnaan kromogen
DAB. Positif, bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada
sitoplasma sel stroma dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 100X dan 400x pada seluruh lapangan
pandang dan pada saat yang sama kontrol + juga menampilkan warna yang sama.
Universitas Sumatera Utara
3.7. Prosedur dan Teknik Penelitian 3.7.1. Pembuatan sediaan mikroskopis
Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut : 1. Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer
sampai cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4 µm. Setiap blok parafin,
dipotong ulang 1 kali untuk pulasan imunohistokimia CD 10. 2. Sampel blok parafin yang sudah dipotong tipis 4 µm
ditempelkan pada kaca objek.
Pada pulasan imunohistokimia CD 10 digunakan kaca objek yang telah di-coating dengan poly-L-lysine atau Silanized slide agar
jaringan dapat menempel pada kaca objek selama proses pulasan imunohistokimia.
Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek silanized adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing. Potongan tipis
dipisahkan dan diratakan dengan memasukkannya ke dalam air hangat. Setelah mengembang, pindahkan ke atas kaca objek.
Selanjutnya, kaca objek diletakkan di atas alat pemanas hot plate. Setelah parafin melunak, kaca objek dikeringkan dan potongan
jaringan siap untuk dipulas.
Universitas Sumatera Utara
3.7.2. Prosedur kerja
Deparafinisasi dengan xylol I, II masing-masing 5 menit. Rehidrasi Alkohol absolute, Alk 96, Alk 80, Alk 70 masing-
masing 5 menit. Cuci dengan air mengalir.
Masukkan slide ke dalam PT Link Dako Epitope Retrieval : set up Preheat 65°C, Running time 98°C selama 15 menit.
Pap Pen. Segera masukkan dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4.
Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 Blocking dengan Normal horse Serum NHS 3 .
Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4. Inkubasi dengan Antibodi Primer sesuai kasus yaitu CD 10 Ready
to Use. Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 Tween 20
Dako Real Envision RabbitMouse. Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 Tween 20.
DAB+Substrat Chromogen solution dengan pengenceran 20 µL DAB : 1000 µL substrat.
Cuci dengan air mengalir. Counterstain dengan Hematoxylin.
Cuci dengan air mengalir. Lithium carbonat 5 dlm aqua 3 celup.
Cuci dengan air mengalir.
Universitas Sumatera Utara
Dehidrasi Alk 80, Alk 96, Alk Abs. Clearing Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3.
Mounting dengan entellan + cover glass.
3.8. Alat dan Bahan Penelitian 3.8.1. Alat-Alat Penelitian
Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah : mikrotom, waterbath, hot plate, freezer, inkubator, staining jar, rak kaca objek,
kaca objek, rak inkubasi, pensil Diamond, pipet mikro, timbangan bahan kimia, kertas saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer,
gelas beker, tabung sentrifuge, Dako PT Link Heat mediated Antigen Retrieval Method, thermolyte stirrer, kaca penutup, entelan
dan mikroskop cahaya.
3.8.2. Bahan Penelitian
Blok parafin yang telah didiagnosis dengan pulasan Hematoksilin Eosin sebagai kista endometriosis ovarium dan
kista lutein berdarah. Antibodi primer yang digunakan adalah Rabbit Polyclonal Hu-
antibody CD 10 Ready to Use. Pulasan imunohistokimia menggunakan metode The EnVision+
Dual Link System kit yang terdiri dari :
Universitas Sumatera Utara
1 botol Dual endogenous enzyme block 15 ml 1 botol Labelled polymer-HRP
15 ml 1 botol DAB+ Substrat Buffer
18 ml 1 botol DAB+ Chromogen
1 ml Larutan TBS
Larutan Tris EDTA Xylol, Alkohol
Lithium carbonat Hematoksilin
Mounting media : entellan
3.9. Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian
yang digunakan
adalah hasil
pulasan imunohistokimia CD 10 terhadap sampel sediaan jaringan kista ovarium.
Untuk penilaian terhadap pulasan imunohistokimia CD 10 adalah sebagai berikut :
Kontrol positif : jaringan limfe nodi. Kontrol negatif : kista ovarium dengan antibodi primer yang
digantikan dengan serum normal. Positif : warna coklat yang tertampil pada sitoplasma sel-sel
stroma pada kista.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 3.1. Intensitas tampilan imunohistokimia CD 10 pada kista endometriosis dan kista lutein berdarah.
INTENSITAS IHK CD 10
Kista endometriosis
Kista lutein berdarah
JUMLAH NEGATIF
POSITIF JUMLAH
Keterangan : Intensitas tampilan CD 10 : Negatif : tidak tertampil
Positif : tertampil warna coklat pada sel stroma.
3.10. Analisa Data
Untuk melihat gambaran karakteristik kista coklat ovarium berupa kista endometriosis dan kista lutein berdarah, disajikan dalam
bentuk tabulasi dan dideskripsikan. Untuk menganalisa perbedaan hasil pulasan hematoksilin-eosin
konvensional terhadap
tampilan imunohistokimia
CD 10
menggunakan uji Chi-square.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil penelitian
Pemeriksaan imunohistokimia CD 10 dilakukan terhadap 44 sediaan blok paraffin jaringan histopatologi kista ovarium yang sebelumnya didiagnosa
dengan pulasan Hematoksilin Eosin sebagai kista endometriosis dan kista lutein berdarah. Berdasarkan umur, distribusi sampel yang dimasukkan dalam
penelitian ini tertampil pada tabel 4.1.
Tabel 4.1. Distribusi umur dari seluruh sampel kista ovarium yang digunakan dalam penelitian.
Umur n
20 tahun 2
4,5 20-35 tahun
30 68,2
35 tahun 12
27,3 Total
44 100,0
Mean = 32,50 SD = 7,407 Minimum = 18 Maksimum = 49
Dari data distribusi yang digambarkan pada tabel 4.1., umur penderita kista
ovarium berupa endometriosis dan kista lutein berdarah yang paling banyak adalah kelompok usia reproduktif yaitu umur 20-35 tahun, dengan jumlah
sampel sebanyak 30 kasus 68,2. Dan sampel yang minimal adalah yang termasuk pada kelompok umur kurang dari 20 tahun, berjumlah 2 orang
4,5.
Universitas Sumatera Utara