Bahan yang digunakan untuk bioassay yaitu ekstrak polar metanol dan air serbuk daun gamal, hama penghisap buah kakao P. minor betina
yang sudah diaklimatisasi selama 1 hari sebelum perlakuan, buah kakao T. cacao yang masih muda sebagai media uji.
3.3. Cara Kerja
3.3.1. Pembuatan Serbuk Daun Gamal
Daun gamal diunduh dan diseleksi yang masih segar, selanjutnya dikering anginkan selama 7-10 hari sampai benar-benar kering. Daun gamal yang
sudah kering dibawa ke laboratorium untuk digiling sampai menjadi serbuk dan dibungkus plastik dalam keadaan vacum lalu disimpan dalam ruang
tertutup agar tidak terjadi kontaminan sampai saatnya digunakan.
3.3.2. Isolasi dan Pemurnian Senyawa Golongan Flavonoid
Daun gamal dimaserasi menggunakan beberapa pelarut untuk memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung didalamnya, sehingga dapat diketahui
jenis senyawa yang dapat digunakan sebagai insektisida nabati. Metanol dan air merupakan pelarut yang paling banyak digunakan dalam proses maserasi
senyawa organik bahan alam Susanti dkk., 2012.
3.3.2.1. Ekstrak Metanol
Sebanyak 500 gram serbuk daun gamal dimaserasi menggunakan pelarut Hexana sebanyak 1.500 ml. Maserasi dengan pelarut hexana dilakukan
selama 1x24 jam kemudian dipisahkan antara filtrat dan endapan. Hal ini dilakukan sebanyak 3 kali ulangan yang bertujuan untuk menarik senyawa-
senyawa nonpolar yang terkandung pada daun gamal.
Setelah itu endapan dimaserasi menggunakan pelarut DCM sebanyak 1.000 ml. Maserasi dengan pelarut DCM dilakukan selama 1x24 jam sebanyak 3
kali ulangan dengan tujuan senyawa-senyawa nonpolar dan semi polar dapat terangkat.
Selanjutnya untuk mendapatkan ekstrak polar metanol endapan dimaserasi menggunakan pelarut metanol sebanyak 1.200 ml. Maserasi dengan pelarut
metanol dilakukan selama 1x24 jam dengan 8 kali ulangan hingga tidak ada lagi senyawa-senyawa organik yang dapat ditarik.
Filtrat metanol selanjutnya dievaporasi hingga tidak ada lagi kandungan metanolnya. Sebanyak 500 ml hasil evaporasi filtrat metanol dipekatkan
dengan metode rekristalisasi menggunakan freeze dryer selama 72 jam hingga membentuk ekstrak kasar dalam bentuk pasta.
