Waktu dan Tempat Penelitian Diagram Alir Penelitian

3.2.4. Uji Insektisida

3.2.4.1. Serangga Uji

Alat yang digunakan untuk pengambilan serangga uji adalah pisau untuk mengambil buah kakao yang dihinggapi serangga uji berupa kutu putih. Toples untuk wadah buah kakao beserta kutu putihnya, kain kassa untuk menutup bagian atas toples. Bahan yang diambil berupa kutu putih kakao P. minor beserta buah kakao sebagai pakan dari desa Banjar Alam Pardasuka, Kecamatan Pardasuka, Kabupaten Pringsewu.

3.2.4.2. Media Uji

Alat yang digunakan untuk persiapan media uji adalah pisau untuk mengambil buah kakao. Plastik untuk wadah buah kakao yang sudah diambil. Bahan yang disiapkan yaitu buah kakao T. cacao yang diambil dari desa Pardasuka, Kecamatan Pardasuka, Kabupaten Pringsewu.

3.2.4.3. Bioassay

Alat yang digunaakan untuk bioassay yaitu toples untuk perendaman dan wadah media uji. Kain kasa untuk penutup toples. Kuas dan jarum pentul untuk membantu memindahkan dan meletakkan serangga uji pada media uji. Bahan yang digunakan untuk bioassay yaitu ekstrak polar metanol dan air serbuk daun gamal, hama penghisap buah kakao P. minor betina yang sudah diaklimatisasi selama 1 hari sebelum perlakuan, buah kakao T. cacao yang masih muda sebagai media uji.

3.3. Cara Kerja

3.3.1. Pembuatan Serbuk Daun Gamal

Daun gamal diunduh dan diseleksi yang masih segar, selanjutnya dikering anginkan selama 7-10 hari sampai benar-benar kering. Daun gamal yang sudah kering dibawa ke laboratorium untuk digiling sampai menjadi serbuk dan dibungkus plastik dalam keadaan vacum lalu disimpan dalam ruang tertutup agar tidak terjadi kontaminan sampai saatnya digunakan.

3.3.2. Isolasi dan Pemurnian Senyawa Golongan Flavonoid

Daun gamal dimaserasi menggunakan beberapa pelarut untuk memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung didalamnya, sehingga dapat diketahui jenis senyawa yang dapat digunakan sebagai insektisida nabati. Metanol dan air merupakan pelarut yang paling banyak digunakan dalam proses maserasi senyawa organik bahan alam Susanti dkk., 2012.

3.3.2.1. Ekstrak Metanol

Sebanyak 500 gram serbuk daun gamal dimaserasi menggunakan pelarut Hexana sebanyak 1.500 ml. Maserasi dengan pelarut hexana dilakukan selama 1x24 jam kemudian dipisahkan antara filtrat dan endapan. Hal ini dilakukan sebanyak 3 kali ulangan yang bertujuan untuk menarik senyawa- senyawa nonpolar yang terkandung pada daun gamal. Setelah itu endapan dimaserasi menggunakan pelarut DCM sebanyak 1.000 ml. Maserasi dengan pelarut DCM dilakukan selama 1x24 jam sebanyak 3 kali ulangan dengan tujuan senyawa-senyawa nonpolar dan semi polar dapat terangkat. Selanjutnya untuk mendapatkan ekstrak polar metanol endapan dimaserasi menggunakan pelarut metanol sebanyak 1.200 ml. Maserasi dengan pelarut metanol dilakukan selama 1x24 jam dengan 8 kali ulangan hingga tidak ada lagi senyawa-senyawa organik yang dapat ditarik. Filtrat metanol selanjutnya dievaporasi hingga tidak ada lagi kandungan metanolnya. Sebanyak 500 ml hasil evaporasi filtrat metanol dipekatkan dengan metode rekristalisasi menggunakan freeze dryer selama 72 jam hingga membentuk ekstrak kasar dalam bentuk pasta. Ekstrak kasar metanol diKLT menggunakan plat KLT selulose 5x2 cm, dengan larutan identifikasi CeSO 4 10 dan H 2 SO 4 15 dengan perbandingan 1:1. Eluen yang digunakan yaitu DCM dan metanol dengan perbandingan 4:1. Selanjutnya untuk pemurnian ekstrak metanol dilakukan dengan cara fraksinasi menggunakan Kromatografi Kolom KK Amberlite XAD-4. Sebanyak 5 gram Amberlite XAD-4 dicuci dengan aquades dan dimasukkan kedalam KK hingga benar-benar tidak ada gelembung udara. Selanjutnya Amberlite XAD-4 dicuci dengan aquades pH 2 sebanyak 100 ml dan pH 5 sebanyak 100 ml. Sebanyak 1 gram ekstrak kasar metanol diencerkan dengan metanol 20 lalu masukkan ke kolom. Masukkan metanol 20 sebanyak 100 ml kedalam kolom. Hasil fraksinasi dipisahkan berdasarkan warna dan berdasarkan volume 30 ml kedalam botol. Selanjutnya masukkan metanol 25 , 30 40, 50, 75, dan 100 dengan cara dan metode fraksinasi yang sama. Fraksi- fraksi yang sudah didapat dianalisis KLT dan dikelompokkan berdasarkan warna dan hasil KLT yang didapat lalu dievaporasi. Hasil evaporasi dianalisis KLT kembali hingga didapatkan fraksi aktif kaya flavonoid yang dapat digunakan untuk Bioassay. Kandungan senyawa flavonoid pada ekstrak daun gamal dapat dilihat dari analisis KLT dengan pelarut visualisasi yaitu SeSO 4 10 dalam akuades, AlCl 3 5 dalam metanol 95, 1 NaOH 2M dalam metanol dan H 3 BO 3 jenuh dalam metanol dan untuk menentukan struktur dapat menggunakan analisis spektroskopis.

3.3.2.2 . Ekstrak Air

Sebanyak 500 gram serbuk daun gamal dimaserasi menggunakan pelarut Hexana sebanyak 1.500 ml. Maserasi dengan pelarut hexana dilakukan selama 1x24 jam kemudian dipisahkan antara filtrat dan endapan. Hal ini dilakukan sebanyak 3 kali ulangan yang bertujuan untuk menarik senyawa- senyawa nonpolar yang terkandung pada daun gamal. Setelah itu endapan dimaserasi menggunakan pelarut DCM sebanyak 1.000 ml. Maserasi dengan pelarut DCM dilakukan selama 1x24 jam sebanyak 3 kali ulangan dengan tujuan senyawa-senyawa nonpolar dan semi polar dapat terangkat. Selanjutnya untuk mendapatkan ekstrak polar metanol endapan dimaserasi menggunakan pelarut metanol sebanyak 1.200 ml. Maserasi dengan pelarut metanol dilakukan selama 1x24 jam dengan 8 kali ulangan hingga tidak ada lagi senyawa-senyawa organik yang dapat ditarik. Setelah maserasi menggunakan metanol dilanjutkan dengan meserasi menggunakan air. Endapan sisa penyaringan ekstrak metanol direndam menggunakan aquades sebanyak 1.200 ml selama 1x24 jam dengan 6 kali pengulangan hingga didapatkan filtrat air yang mengandung senyawa-senyawa polar. Sebanyak 500 ml filtrat air serbuk daun gamal dipekatkan dengan metode rekristalisasi menggunakan freeze dryer selama 72 jam hingga didapat ekstrak kasar air dalam bentuk pasta. Ekstrak kasar air diKLT menggunakan plat KLT selulose 5x2 cm dengan larutan identifikasi CeSO 4 10 dan H 2 SO 4 15 dengan perbandingan 1:1. Eluen yang digunakan yaitu DCM dan metanol dengan perbandingan 4:1. Ekstrak kasar air selanjutnya dihidrolisis. Sebanyak 2,5 gram dimasukkan kedalam erlenmeyer, ditambahkan HCl sebanyak 7,5 ml dan metanol sebanyak 5 ml. Selanjutnya dipanaskan pada suhu 60 o C selama ± 1 jam hingga ikatan glukosida benar-benar terputus. Selanjutnya ekstrak yang sudah dipanaskan disaring dan diambil sebanyak 1,5 ml dan dimasukkan kedalam corong pisah kemudian ditambahkan 1,5 ml NaCl dan 3 ml etil asetat, lalu dikocok dan diekstraksi. Hasil ekstraksi menunjukkan dua fase, yaitu fase air dan fase etil asetat. Fase air berwarna kekuningan sedangkan fase asetat berwarna kecoklatan. Pada fase air terdapat endapan berupa kristal. Selanjutnya hasil hidrolisis dipantau dengan KLT. Kandungan senyawa flavonoid pada ekstrak daun gamal dapat dilihat dari analisis KLT dengan pelarut visualisasi yaitu SeSO 4 10 dalam akuades, AlCl 3 5 dalam metanol 95, 1 NaOH 2M dalam metanol dan H 3 BO 3 jenuh dalam metanol. Hasil hidrolisis yang sudah dianalisis KLT selanjutnya dibioassay terhadap kutu putih pada tanaman kakao dengan konsentrasi 0, 0,015, 0,030, 0,045, dan konsentrasi 0,060 serta dilakukan uji spektroskopis untuk menentukan panjang gelombang sebagai penentu senyawa golongan flavonoid. 3.3.3. Bioassay Fraksi yang Didapat 3.3.3.1. Bioassay Fraksi Aktif Terhadap Hama Planococcus minor Setiap senyawa yang ditemukan pada tahapan fraksinasi dilakukan bioassay terhadap hama kutu putih P. minor dan media uji yang digunakan adalah buah kakao T. cacao tempat P. minor hidup. Hal ini dilakukan untuk menapis senyawa aktif insektisida. Bioassay yang dilakukan adalah uji mortalitas dengan pengaruh residu residual effect. Uji residu dilakukan dengan merendam media uji dengan 5 taraf tingkatan konsentrasi 0, 0,015, 0,030, 0,045 dan 0,060 selama 10 menit, 10 ekor serangga uji P. minor betina yang sudah diaklimatisasi selama 1 hari sebelum perlakuan diletakkan pada media uji dan dipelihara pada waadah uji. Pengamatan mortalitas serangga uji dilakukan pada 12, 24, 48 dan 72 jam setelah perlakuan. Presentase kematian untuk setiap ekstrak akan dianalisis dengan program analisis probit EXE untuk menentukan hubungan konsentrasi dengan kematian serangga. Larutan uji dikatakan efektif bila larutan tersebut memberikan nilai LC 50 ≤ 5 Prijono, 2005. Percobaan ini dilakukan masing-masing 3 kali ulangan.

3.3.3.2. Penentuan Struktur Senyawa Murni Aktif

Setelah diperoleh fraksi aktif dan efektif sebagai insektisida senyawa flavonoid dianalisis dengan menggunakan metoda KLT. Isolat murni selanjutnya diujikan ke organisme target yakni P. minor pada skala laboratorium bioassay. Selanjutnya senyawa murni aktif dan efektif yang diperoleh dianalisis strukturnya dengan metoda spektroskopis, UV-Vis. Cara kerja mulai dari persiapan sampel, pembuatan ekstrak dan bioassay untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada bagan alir.

3.3.3.3. Analisis Data

Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis menggunakan analisis probit untuk menentukan nilai LC 50 , uji Anara dan uji lanjut dengan Tukey ’ s digunakan untuk menentukan larutan yang efektif sebagai insektisida nabati.

3.4. Diagram Alir Penelitian

Gambar 7. Bagan Alir Penelitian “Daya Insektisida, Jenis, dan Struktur Isolat Murni Ekstrak Polar Serbuk Serbuk Daun Gamal Gliricidia maculata Hbr. Terhadap Kutu Putih Planococcus minor Maskell Pada Tanaman Kakao Theobroma cacao L. ” Analisis Spektroskopis Penentuan struktur senyawa murni aktif dari ekstrak yang efektif Didapat jenis dan struktur isolat murni yang efektif mematikan dan mengendalikan hama kutu putih pada tanaman kakao Pengambilan daun gamal Pembuatan serbuk daun gamal  Daun segar  Dikering angin 7-10 hari  Digiling Pembuatan isolat murni ekstrak polar serbuk daun gamal Bioassay  Perendaman media uji masing-masing pada ponsentrasi 0, 0,015, 0,030, 0,045 dan 0,060selama 10 menit lalu kering anginkan  10 seragga uji diletakkan pada media uji  Pengamatan pada 12, 24, 48 dan 72 jam setelah perlakuan, LC 50 Uji insektisida Serangga uji  Imago P. minor betina  n = 150, r = 3  Aklimatisasi 1 hari Media uji  Buah kakao muda  n = 15, r =3  Senyawa aktif ekstrak metanol imurnikan dengan KK AmberliteXAD-4 dan KLT  Senyawa aktif dan efektif ekstrak air dimurnikan dengan metode hidrolisis Bioassay isolat murni terhadap P. minor pada skala laboratorium Gambar 8. Bagan alir isolasi dan penentuan senyawa murni ekstrak polar metanol dan air serbuk daun gamal Gliricidia maculata Hbr. Ekstrak metanol  Heksana  DCM  Metanol Fraksinasi dengan KK AmberliteX AD- 4 dan dipantau dengan metoda KLT Fraksi kaya flavonoid Bioassay fraksi kaya flavonoid Fraksi aktif Isolat murni dan aktif Ekstrak air  Heksana  DCM  Metanol  Air Freeze dryer Endapan FE Filtrat FA Kristalisasi Fase kaya flavonoid Bioassay ekstrak air Analisis Spektroskopis Isolat murni dan aktif Kristal Isolat murni Isolat murni Analisis Spektroskopis Didapat jenis dan senyawa flavonoid yang efektif mematikan kutu putih Hidrolisis Bioassay ekstrak kasar Evaporasi dan Freeze dryer Refraksinasi Bioassay ekstrak kasar

V. SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian diperoleh kesimpulan sebagai berikut: 1. Ekstrak metanol dan ekstrak air serbuk daun gamal G. maculata memiliki daya insektisida terhadap kutu putih P. minor pada tanaman kakao T. cacao. 2. Ekstrak metanol dan ekstrak air serbuk daun gamal mengandung senyawa flavonoid jenis flavon dan struktur jenis senyawanya terdiri dari kerangka struktural 2-fenil-1,4-benzopiron.

5.2. Saran

Ekstrak metanol dan ekstrak air serbuk daun gamal dengan konsentrasi 5 sudah efektif dalam mematikan hama kutu putih. Disarankan untuk peneliti selanjutnya penelitian dilakukan terhadap serangga uji yang berbeda dan untuk uji KLT sebaiknya visualisasi dilakukan juga dibawah sinar UV. DAFTAR PUSTAKA Afriyorawan. 2013. Karakterisasi senyawa Flavonoid Hasil Isolasi Ekstrak Metanol Daun Gamal Gliricidia maculata. Skripsi. Universitas Lampung. Lampung. Badan Litbang Pertanian. 2011 a. Manfaat Biji Kakao Untuk Kesehatan. PBTP Sulawesi Tenggara. Badan Litbang Pertanian. 2011 b. Daun Gamal Gliricidia sepium Obat Scabies Pada Kambing. Sinar Tani. Edisi 30 Maret-5 April 2011 No.3399 Tahun XLI. BBPP, Balai Besar Pelatihan Peternakan. 2015. Daun Gamal Obat Scabies Pada Kambing . http:bbppbatu.bppsdmp.pertanian.go.id . Diakses 17 September 2015 pukul 15.52 WIB. Brybrook, D., Solutions, V. 2012. Mealybug Management. Australian Goverment Grape and Wine Research and Development Corporation. http:www.gwrdc.com.au. Diakses 1 Juni 2015, pukul 14.09 WIB. Direktorat Pakan Ternak. 2012. Limbah Kakao Sebagai Alternatif Pakan Ternak. http:www.ditjennak.pertanian.go.id. Diakses 10 Mei 2015, pukul 13.04 WIB. Direktorat Jenderal Perkebunan. 2009. Pengenalan Pestisida. http:www.ditjenbun.pertanian.go.id. Diakses 28 September 2015, pukul 13.56 WIB. Direktorat Pembenihan Tanaman Hutan. 2002. Gliricidia sepium Jacq. Steud. Informasi Singkat Benih. http:www.dephut.go.idinformasi.rrlGliricidiasepim.pdf. Diakses 7 Mei 2015, pukul 12.49 WIB. Elevitch, C. R Francis, J. K. 2006. Gliricidia sepium gliricidia Fabaceae legume family. Spesies Profiles For Pasific Island Agroforestry. www.traditionaltree.org. Diakses 7 Mei 2015, pukul 12.26 WIB. Francis, A. W., Kairo, M.T.K., Roda, A.L. 2012. The passionvine mealybug, Planococcus minor Maskell Hemiptera: Pseudococcidae. University of Florida. Gafur, M. A., Isa, I., Bialangi, N. 2014. Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Flavonoid Dari Daun Jamblang Syzygium cumini. Skripsi. Jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Negeri Gorontalo. Gorontalo . Ghasemzadeh, A. Ghasemzadeh, N. 2011. Flavonoids and phenolic acids: Role and biochemical activity in plants and human. Journal of Medicinal Plants Research Vol. 531, pp. 6697-6703. Available online at http:www.academicjournals.orgJMPR, ISSN 1996-0875 ©2011 Academic Journals DOI: 10.5897JMPR11.1404. Iran. Harborne, J. B. Williams, C. A. 2000. Advances in Favonoid research since 1992. Phytochemistry 55 2000 481-504. Joker. 2002. Gliricidia sepium Jacq. Steud. Danidia Forest Seed Centre. Denmark. Kementerian Pertanian, Ditjen Peternakan Keswan. 2009. Keunggulan Gamal Sebagai Pakan Ternak. BPTU Sembawa. Sumatera Selatan. Khopkar, S. M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI Press. Jakarta. Koswara, S. 2006. Manajemen Pengendalian Hama Dalam Industri Pangan. eBookPangan.com. http:tekpan.unimus.ac.idwp. Diakses 9 Mei 2005, pukul 01.14 WIB. Kumar, S., Pandey, A. K. 2013. Chemistry and Biological Activities of flavonoids.The Scientific Word Journal. Vol.2013.Article ID 162750,16 pages. India. Marais, J.P.J., Vours, B. D., Dixon, R.A., Ferreira, D. 2006. The Stareochemistry of Flavonoids.Springer Science.ISBN-10 0-387-28821. United Dtates of America. America. Martin, J. L., Mau, R.F.L. 2007. Mealybug. Department of Entomology. Honolulu-Hawai. Nazli, R., Sohail,T., Nawab, B., Yaqeen, Z. 2011. Antimicrobial Property Of Gliricidia Sepium Plant Extract. Journal Agriculture Resource. Vol 24 No.1-4. Pakistan. Neldawati, Ratnawulan, dan Gusnedi. 2013. Analisis Nilai Absorbansi Dalam Penentuan Kadar Flavonoid UntukBerbagai Jenis Daun Tanaman Obat. Pillar Of Physics, Vol. 2. Oktober 2013, 76-83 Nukmal, N., Widiastuti, E.L., Sumiyani, E. 2009. Uji Efikasi Ekstrak Daun Gamal Gliricidia maculata Terhadap Imago Hama Bisul Dadap Quadrastichus erythrinae. Prosiding Seminar Nasional XX dan Kongres Biologi Indonesia XIV. Malang 24 -25 Juli 2009. Nukmal, N., Utami,N., Suprapto. 2010. Skrining Potensi Daun Gamal Gliricidia maculata Hbr. Sebagai Insektisida Nabati. Laporan Penelitian Hibah Strategi Unila. Universitas Lampung. Nukmal, N., Utami, N., Pratami, G. D. 2011. Isolasi Senyawa Flavonoid Dari Ekstrak Air Serbuk Daun Gamal Gliricidia maculata Dan Uji Toksisitasnya Terhadap Hama Kutu Putih Pepaya Paracoccus marginatus. Prosiding Penelitian Hibah Strategi Unila. Universitas Lampung. 2010. Orwa, C., Mutua, A., Kindt, R. , Jamnadass, R., Anthony, S. 2009. Agroforestry Database 4.0 : Gliricidia sepium. http:www.worldagroforestry.orgsitestreedbstreedatabases.asp. Diakses 10 Mei 2015, pukul 16.09WIB. Pratami,G. D. 2011. Isolasi Senyawa Flavonoid Dari Ekstrak air Serbuk Daun Gamal Gliricidia maculata Dan Uji Toksisitasnya Terhadap Hama Kutu Putih Pepaya Paracoccus marginatus. Skripsi. Universitas lampung. Lampung. Puspitasari. 2008 .Uji Sitotoksik Ekstrak Petroleum Eter Herba Bandotan Ageratum Conyzoides L. Terhadap Sel T47d Dan Profil Kromatografi Lapis Tipis. http:eprint.ums.ac.id. Diakses 16 Juli 2016, Pukul 11.32 WIB. Prijono, D. 2005. Pemanfaatan dan Pengembangan Pestisida Nabati. Makalah Seminar Ilmiah. Jurusan Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas lampung. Raini, M. 2007. Toksikologi Pestisida dan Penanganan Akibat Keracunan Pestisida. Media Litbang kesehatan Vol. XVII.No.3.Departemen Kesehatan. Jakarta. Rohyami, Y. 2008. Penentuan Kandungan Flavonoid dari Ekstrak Metanol Daging Buah Mahkota Dewa Phaleria macrocarpa Scheff Boerl. Jurnal Penelitian Pengabdian dppm.uii.ac.id. Yogyakarta. Selawa, W., Runtuwene, M. R. J., Citraningtyas, G. 2013. Kandungan Flavonoid Dan Kapasitas Antioksidan Total Ekstrak Etanol Daun Binahong [Anredera cordifoliaTen.Steenis.]. Jurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT Vol. 2 No. 01 ISSN 2302 - 2493 . Manado. Siregar, A. Z. 2007. Kakao yang Nikmat Sulit Dirawat. Repository. Universitas Sumatera Utara. Medan. Diakses 08 April 2015, pukul 14.30. Siswanto Karmawati, E. 2012. Control Of Cocoa Main Pest Conomorpoha cramerella And Helopeltis spp. Using Botanical Pesticide And Biological Agents. Pusat Penelitian dan Pengembangan Perkebunan. Perspektif Vol. 11 No. 2. ISSN: 1412 - 8004. Hlm 103 - 99. Bogor.