3.7.4 Pembuatan Suspensi Bakteri
Kegiatan pembuatan suspensi bakteri menggunakan Aa yang telah dibiakkan secara murni pada media
Tryptic Soy Agar TSA dalam suasana anaerob.
Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCL 0,9 sampai
diperoleh kekeruhan sesuai standar Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10
8
CFUml.
3.7.5 Pembuatan Kontrol Positif
Kontrol positif yang digunakan adalah suspensi bakteri yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya. Suspensi bakteri tersebut diambil sebanyak 2 ml dengan
menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam microplate.
3.7.6 Pembuatan Kontrol Negatif
Kontrol negatif yang digunakan adalah ekstrak kulit buah delima tanpa suspensi bakteri. Ekstrak ini diambil sebanyak 2 ml dengan menggunakan mikropipet
dan dimasukkan ke dalam microplate.
3.7.7 Penentuan KHM Bahan Coba
Bahan coba ekstrak buah delima yang dipakai terdiri dari konsentrasi 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,6125 dan 0,8. Dari masing-masing konsentrasi tersebut
diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam microplate kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah
dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing microplate bahan coba yang telah diberi label kemudian
dihomogenkan. Microplate tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO
2
dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung- tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing
bahan coba Gambar 12. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau
Universitas Sumatera Utara
bahan uji apapun yang menghambat pertumbuhan Aa dalam media perbenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri dalam perbenihan tersebut.
Gambar 12. Media perbenihan setelah diinkubasi
3.7.8 Penentuan KBM bahan coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan perhitungan
jumlah koloni bakteri yaitu pada konsentrasi 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,6125
dan 0,8 dengan metode Drop Plate Miles Mesra. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing-masing dihomogenkan dan diambil 50
�l untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat
Tryptic Soy Agar TSA dan direplikasi 4 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi
dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37°C selama 24 jam Gambar 13;Gambar 14. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan menggunakan kaca pembesar
dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap
berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unitml cairansuspensi
Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah reratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan
faktor pengali. Oleh karena itu, konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor
Universitas Sumatera Utara
pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50
�l, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.
Gambar 13. Cawan petri dengan berbagai konsen trasi yang telah diteteskan dengan
suspensi bakteri dan ekstrak kulit buah delima
Gambar 14. Cawan petri diinkubasi pada inkubator CO
2
Universitas Sumatera Utara
3.8 Skema Alur Penelitian
Kategori