alginat, alginat-susu skim-inulin dan alginat-tepung kedelai-inulin. Karakterisasi bahan enkapsulan yang paling efektif menjaga sel pada ketiga jenis kapsul
dilakukan dengan menghitung viabilitas selama penyimpanan pada suhu 4 °C dan 27 °C selama 4 minggu.. Karakterisasi sel bebas dan sel dalam ketiga jenis kapsul
juga dilakukan terhadap kondisi asam lambung tiruan dengan variasi pH 2, 3 dan 6 dengan interval 30 menit selama 2 jam dengan menghitung viabilitas sel setelah
dimasukkan dalam larutan asam lambung tiruan.
3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Persiapan Kultur BAL
Isolat kultur koleksi bakteri asam laktat dari media miring diinokulasikan sebanyak satu ose ke dalam media MRSB kemudian diinkubasi selama 48 jam
pada suhu 37 °C. Kemudian dilakukan pemeriksaan kemurnian kultur. Pemeriksaan kemurnian kultur BAL potensial dilakukan untuk memastikan
kemurnian kultur yang dilakukan melalui pemeriksaan morfologi secara mikroskopik dengan metode pewarnaan Gram dan uji katalase. Metode
pewarnaan mengacu pada Fardiaz 1989, yaitu preparat bakteri yang telah dioleskan pada gelas objek, ditetesi dengan kristal violet dan dibilas dengan
akuades. Preparat dikeringudarakan kemudian ditetesi dengan larutan lugol iodin dan kembali dibilas dengan akuades. Preparat kemudian dikering-udarakan,
selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95 sebagai bahan pemucat. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin, pembilasan dilakukan dengan auades, preparat
dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x. Metode pengujian katalase mengacu pada McFaddin
1983, uji katalase dilakukan dengan meneteskan larutan H
2
O
2
3 pada kultur muda umur 24 jam. Sifat reaksi terhadap uji katalase ditentukan dengan
pemunculan gelembung gas CO
2
merupakan hasil positif terhadap pengujian.
3.4.2 Seleksi BAL Potensial Sebagai Kandidat Probiotik
Dalam pengujian isolat potensial BAL digunakan kertas cakram kosong dengan diameter 6 mm. Cakram dimasukkan ke dalam cawan petri kosong steril.
Sebanyak 5 isolat kultur cair bakteri BAL dengan kepadatan sel 10
8
cfuml
Universitas Sumatera Utara
kemudian dipipet sebanyak 10 µl selanjutnya diteteskan pada permukaan kertas cakram dan ditunggu selama ± 1 jam hingga kultur BAL berdifusi ke dalam
cakram. Cakram ini akan digunakan untuk uji antagonis dengan bakteri patogen uji.
Sebanyak 10 ml media MHA masing-masing dituangkan ke dalam petri steril dan dibiarkan memadat. Cotton bud steril dicelupkan ke dalam masing-
masing suspensi biakan bakteri patogen Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Salmonella thypimurium masing-masing dengan kepadatan sel 10
8
cfuml dan diusapkan perlahan-lahan pada permukaan media uji secara merata, selanjutnya
dibiarkan mengering pada suhu kamar selama beberapa menit. Dengan menggunakan pinset steril, cakram yang telah ditetesi kultur BAL diletakkan
secara teratur pada permukaan media uji. Kultur uji diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C di dalam inkubator.
Setelah masa inkubasi, diameter zona hambat daerah bening di sekitar cakram diukur dengan menggunakan jangka sorong. Aktivitas senyawa antimikroba BAL
dapat dilihat dengan adanya zona hambat di sekitar cakram. Daerah bening di sekitar cakram menunjukkan uji positif. Isolat yang menunjukkan zona bening
terbesar dipilih untuk uji selanjutnya.
3.4.3 Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri asam laktat dilakukan dengan metode Cappucino Sherman 1987 untuk mengetahui jumlah sel BAL pada Optical
DensityOD tertentu dan untuk mengetahui waktu pemanenan BAL. Pembuatan kurva dilakukan dengan menggunakan medium MRSB. Modifikasi dari metode
Cappucino Sherman 1987 ialah jenis media yang digunakan yaitu MRSB. Sebelumnya perlu dilakukan aktivasi terhadap isolat bakteri. Pertama, sebanyak 1
ose kultur kerja diinokulasi ke dalam 10 ml MRSB, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Kedua, sebanyak 1 ml kultur aktivasi pertama diinokulasikan ke dalam 9 ml MRSB. Ketiga, sebanyak 2 ml dari aktivasi kedua dimasukkan ke
dalam 18 ml MRSB diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Inokulum untuk kurva pertumbuhan memiliki jumlah sel yang disiapkan
dengan cara memindahkan 5 ml kultur dari Erlenmeyer pada aktivasi ketiga ke
Universitas Sumatera Utara
dalam Erlenmeyer yang berisi 45 ml MRSB dan diinkubasi pada suhu 37
o
C. Kerapatan optik optical densityOD biakan tersebut diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm hingga kerapatan optiknya setara 0.5. Sebanyak 20 ml 10 vv inokulum dengan biakan dengan OD 0.5
Pembuatan kurva pertumbuhan diawali dengan memasukkan 20 ml yang telah diketahui kerapatan optiknya ke dalam 180 ml MRSB dan diinkubasi selama 24
jam pada suhu 37
o
C. Kurva pertumbuhan dibuat dengan mengukur kerapatan optik dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm
setiap 3 jam selama 24 jam. Hasil yang didapat dikonversi sebagai kurva pertumbuhan bakteri yang dapat menjadi acuan sebagai waktu pemanenan bakteri
asam laktat pada pengujian selanjutnya.
3.4.4 Enkapsulasi dan Pengeringan Sinbiotik dengan Teknik Ekstrusi
