Alat dan Bahan .1 Alat-alat Pengumpulan Tumbuhan Pecut Kuda Identifikasi Tumbuhan Pembuatan Simplisia Pembuatan Ekstrak n-Heksan Pecut Kuda

17

BAB III METODE PENELITIAN

Penelitian ini bersifat eksperimental yang terdiri dari beberapa tahapan meliputi: pengumpulan tumbuhan pecut kuda, identifikasi tumbuhan, pembuatan simplisia pecut kuda, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak n-heksan pecut kuda, dan pengujian efek diuretik menggunakan rancangan acak lengkap RAL. Data yang diperoleh di analisis secara ANAVA analisis variansi dan dilanjutkan dengan uji beda rata-rata Tukey menggunakan program statistical and product service solution SPSS 17.0. 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat-alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, neraca listrik Chyo JP2-6000, timbangan hewan Chyo JP2-6000, rotary evaporator Heidolph vv-2000, freeze dryer Modulyo, Edwards serial no: 3985, mortir dan stamper, oral sonde, aluminium foil, waterbath, mikroskop, seperangkat alat pengujian diuresis berupa modifikasi kandang metabolik, AAS Shimadzu AA 6200.

3.1.2 Bahan-bahan

Bahan tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tumbuhan pecut kuda. Bahan kimia yang digunakan adalah n-heksan, akuades, karboksi metil selulosa natrium Na-CMC, tablet furosemid. Universitas Sumatera Utara 18

3.2 Pengumpulan Tumbuhan Pecut Kuda

Pengumpulan tumbuhan dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pecut kuda yang diambil dari daerah Bukit Simarsayang, Kota Padang Sidempuan, Provinsi Sumatera Utara.

3.3 Identifikasi Tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi Bogor. Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sama dengan yang digunakan oleh Melida Kristina Baringbing seperti tertera pada lampiran 1.

3.4 Pembuatan Simplisia

Tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah pecut kuda yang masih segar. Tumbuhan dibersihkan dari pengotor lain seperti tanah dan serangga, lalu dicuci hingga bersih kemudian ditiriskan, dipotong-potong dan ditimbang, diperoleh berat basah sebesar 3,6 kg. Tumbuhan tersebut kemudian dikeringkan dalam lemari pengering pada temperatur ± 40ºC sampai tumbuhan kering. Simplisia yang telah kering diblender menjadi serbuk, ditimbang dan diperoleh berat simplisia sebesar 1,5 kg, lalu dimasukkan ke dalam wadah plastik bertutup rapat dan disimpan pada suhu kamar Ditjend, POM., 1989.

3.5 Karakterisasi Simplisia

Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut dalam air, Universitas Sumatera Utara 19 penetapan kadar sari larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut dalam asam Ditjend, POM., 1989.

3.5.1 Pemeriksaan makroskopik dan organoleptik

Pemeriksaan makroskopik dan organoleptik dilakukan dengan mengamati bentuk, rasa, bau, dan warna dari simplisia pecut kuda.

3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik terhadap simplisia dilakukan dengan cara menaburkan serbuk simplisia diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup kemudian diamati dibawah mikroskop Ditjend, POM., 1989.

3.5.3 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu kaca, tabung silinder, tabung pendingin, tabung penyambung dan tabung penerima. Caranya: a. destilasi pertama Dibersihkan tabung penerima dan pendingin pada alat, dibilas dengan air dan dikeringkan. Masukkan 200 ml toluena dan 2 ml air ke dalam labu yang kering. Dipanaskan alat untuk mendestilasi cairan selama 2 jam. Dibiarkan dingin selama 30 menit dan dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml. b. destilasi kedua Timbang secara seksama bahan yang diharapkan memberikan 2-3 ml air dan dimasukkan ke dalam labu. Tambahkan sedikit porselin dan dipanaskan alat selama 15 menit. Ketika mulai mendidih, kecepatan destilasi diatur 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi Universitas Sumatera Utara 20 dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, dibilas bagian dalam tabung pendingin dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, hentikan pemanasan, dibiarkan tabung penerima dingin pada suhu kamar dan keluarkan tetesan air yang menempel pada dinding tabung penerima dengan menepuk tabung. Dibiarkan lapisan air dan toluen memisah dan baca volume airnya WHO, 1998.

3.5.4 Penetapan kadar sari larut dalam air

Sebanyak 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1000 ml dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan dalam oven pada suhu 105ºC sampai diperoleh bobot konstan. Kadar sari yang larut di dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes, RI., 1995.

3.5.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan dalam oven pada suhu 105ºC sampai diperoleh bobot konstan. Kadar sari yang larut di dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes, RI., 1995. Universitas Sumatera Utara 21

3.5.6 Penetapan kadar abu total

Timbang saksama dalam kurs porselin yang telah ditara sejumlah contoh setara dengan 2 g sampai 4 g bahan yang telah dikeringkan di udara, pijarkan perlahan-lahan, kemudian naikkan suhu secara bertahap hingga 675°C ± 25°C sampai bebas karbon dan tetapkan bobot abu. Jika abu bebas karbon tidak dapat diperoleh dengan cara tersebut, lakukan penyarian dengan air panas, tampung sisa yang tidak larut pada kertas saring bebas abu, pijarkan residu dan kertas saring sampai abu berwarna putih atau hampir putih, kemudian tambahkan filtrat, uapkan sampai kering, dan panaskan hingga suhu 675°C ± 25°C. Jika abu bebas karbon tidak dapat diperoleh dengan cara ini, dinginkan kurs porselin, tambahkan 15 ml etanol pekat, lepaskan abu dengan pengaduk gelas, bakar etanol dan panaskan lagi isi kurs porselin hingga suhu 675°C ± 25°C. Dinginkan dalam desikator, timbang abu dan hitung kadar abu dalam persen terhadap bobot contoh yang digunakan Depkes, RI., 1995.

3.5.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam

Didihkan abu yang diperoleh seperti yang tertera pada penetapan kadar abu dengan 25 ml asam klorida selama 5 menit, kumpulkan bagian tidak larut pada kurs yang telah ditara atau kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, pijarkan dan timbang. Hitung kadar abu tidak larut dalam asam dalam persen, dihitung terhadap bobot contoh yang digunakan Depkes, RI., 1995.

3.6 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia dilakukan terhadap simplisia dan ekstrak n-heksan pecut kuda. Skrining fitokimia bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa kimia yang terkandung dalam simplisia dan ekstrak pecut kuda. Uji yang Universitas Sumatera Utara 22 dilakukan meliputi skrining terhadap golongan alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, glikosida, dan steroidtriterpen Depkes, RI., 1995; Harborne, 1987.

3.6.1 Pemeriksaan alkaloida

Simplisia atau ekstrak n-heksan pecut kuda ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu kedalamannya dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, 2 tetes pereaksi Bouchardat, 2 tetes pereaksi Dragendroff. Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan diatas Depkes, RI., 1979.

3.6.2 Pemeriksaan flavonoida

Sebanyak 10 g simplisia atau ekstrak n-heksan pecut kuda ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.

3.6.3 Pemeriksaan glikosida

Simplisia dan ekstrak n-heksan pecut kuda ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 96 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropil Universitas Sumatera Utara 23 dan kloroform 2:3, dilakukan berulang kali sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50ºC. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara perlahan- lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan ikatan gula Depkes, RI., 1979.

3.6.4 Pemeriksaan saponin

Simplisia atau ekstrak n-heksan pecut kuda ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1 - 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes, RI., 1995.

3.6.5 Pemeriksaan tanin

Simplisia atau ekstrak n-heksan pecut kuda ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 30 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1 - 2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tannin Farnsworth, 1966.

3.6.6 Pemeriksaan steroidatriterpenoida

Sebanyak 1 g simplisia atau ekstrak n-heksan dimaserasi dengan 20 ml n- heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan beberapa tetes pereaksi Lieberman-Burchard. Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida, sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoida Harborne, 1987. Universitas Sumatera Utara 24

3.7 Pembuatan Ekstrak n-Heksan Pecut Kuda

Pembuatan ekstrak n-heksan pecut kuda dilakukan secara maserasi dengan menggunakan pelarut n-heksan. Caranya, sebanyak 1200 g serbuk simplisia pecut kuda dimasukkan ke dalam bejana kaca kemudian dituangi cairan penyari sebanyak 75 bagian cairan penyari n-heksan 9 liter, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, lalu disaring, di remaserasi ampas dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian 12 liter, maserat dipindahkan kedalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat yang sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari, lalu di enaptuangkan atau disaring. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator. Kemudian dikeringkan dengan freeze dryer sehingga diperoleh ekstrak kental Depkes, RI., 1979.

3.8 Penyiapan Bahan Uji, Obat Pembanding dan Kontrol