b. Penentuan nilai KBM
Dari hasil penentuan nilai KHM diperoleh beberapa kelompok yang dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan metode Drop Plate Mills Mesra.
- Kelompok I
: ekstrak dengan konsentrasi 100 = 5 sampel -
Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50
= 5 sampel -
Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25
= 5 sampel -
Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5 = 5 sampel
- Kelompok V
: ekstrak dengan konsentrasi 6,25 = 5 sampel -
Kelompok VI : kontrol Mac Farland
= 1 sampel -
Kelompok VII : control negatif ekstrak kulit buah jeruk nipis tanpa 27 suspensi
Aggregatibacter actinomycetemcomitans = 1 sampel
Jumlah sampel = 27 sampel
3.4 Variabel Penelitian Variabel Bebas
- Ekstrak kulit jeruk nipis dengan pelarut etanol dengan konsentrasi 100, 50,
25, 12,5, 6,25
Variabel Tergantung
- Pertumbuhan bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans pada media TSA
dengan pengukuran nilai KHM dan KBM.
Variabel terkendali:
- Asal tumbuh pohon jeruk nipis - Kondisi kulit buah jeruk nipis
- Cara ekstraksi kulit jeruk nipis bahan, alat, metode, tempat penyimpanan, cara penyimpanan
- Media tumbuh bakteri
Variabel Tak Terkendali :
- Pola pemeliharaan pohon jeruk nipis
-
Kondisi tanah tempat pohon jeruk nipis tumbuh
Universitas Sumatera Utara
3.5 Definisi Operasional
- Ekstrak kulit jeruk nipis adalah ekstrak yang diperoleh dengan melakukan ekstraksi
kulit jeruk nipis yang telah diperkolasi dengan pelarut etanol 96 sehingga diperoleh ekstrak kental kulit jeruk nipis.
- Kulit jeruk yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit jeruk yang segar dan
bewarna hijau, diperoleh dengan cara buahnya dibelah dua, dagingnya dikeruk keluar dan kulitnya diambil
- Koloni Aggregatibacter actinomycetemcomitans adalah bakteri Aggregatibacter
actinomycetemcomitans yang berasal dari stem cell Aggregatibacter actinomycetemcomitans dan kemudian dikultur pada media Triptic Soy Agar TSA dalam suasana anaerob.
- KHM Konsentrasi Hambat Minimum adalah konsentrasi minimal bahan coba
yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi selama 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri pada media pembenihan dengan menggunakan metode dilusi.
- KBM Konsentrasi Bunuh Minimum adalah konsentrasi minimal bahan coba yang
dapat membunuh 99,9 atau 100 bakteri setelah dilakukan uji dilusi selama 24 jam, dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada media padat dengan menggunakan metode Drop
Plate Mills Mesra.
3.6 Bahan dan Alat Penelitian 3.6.1 Bahan Penelitian
-
Buah jeruk nipis sebanyak 2000 gram
-
Pelarut etanol 96 sebanyak 5 liter Kimia Farma, Indonesia
-
Suspensi Aggregatibacter actinomycetemcomitans UNAIR, Indonesia
- Media Triptic Soy Agar TSA
3.6.2 Alat Penelitian
-
Vacuum Rotary Evaporator Heidolph VV 2000, Germany
-
Aluminium foil 1 gulungan
-
Erlenmeyer Pyrex, USA
Universitas Sumatera Utara
-
Destilator
-
Lemari penyimpanan petri
-
Blender Panasonik, Japan
-
Kertas Saring Whatman no. 42, England
-
Autoklaf Tomy, Japan
-
Electronic Balance Ohyo JP2 6000, Japan
-
Pipet mikro dan tips Gilson, France
-
Kaca Pembesar Ootsukda ENV-CL, Japan
-
Ose, Spirtus
3.7 Proses Pengambilan dan Pengumpulan Data 3.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk Nipis
Buah yang dipakai adalah buah yang segar, berwarna hijau muda. Bahan baku berupa buah jeruk nipis sebanyak 2000 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, ditimbang,
dikupas kulitnya, diiris halus dan dikeringkan di lemari pengering selama lebih kurang 10 hari. Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia.
Kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 96. Diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Setelah 3 jam,
simplisia diperkolasi dengan menggunakan perkulator yang ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Bagian ujung alat
perkulator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring. Setelah 24 jam, bagian ujung perkulator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka
dengan kecepatan tetesan ±20 tetesmenit. Sampel pada tabung perkulator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan
perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih. Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan 1
ATM dengan temperatur ≤50
o
C. Hasil akhir yang didapat adalah ekstrak kental kulit buah jeruk nipis.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2: a. Jeruk nipis yang dikumpulkan, b. Jeruk nipis ditimbang sebelum dikupas
kulitnya, c. Kulit jeruk nipis yang sudah kering diblender menjadi simplisia, d. Serbuk simplisia kulit jeruk nipis sesudah diblender, e. Simplisia dicampur
dengan etanol 96 untuk diperkolasi.
3.7.2 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media Triptic Soy Agar TSA sebanyak 20 gram bubuk TSA dilarutkan ke dalam 500 ml aquades untuk 40 petri 20mlpetri, lalu
disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121
o
C. Setelah disterilkan, media disimpan dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali,
maka media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
a
c b
d e
Universitas Sumatera Utara
Gambar 3. Penimbangan bubuk media TSA
Gambar 5. Media TSA cair Gambar 6. Uji bakteri
Gambar 4. Sterilisasi TSA yang masih cair di dalam
autoklaf.
Universitas Sumatera Utara
3.7.3 Pembiakan Spesimen
Kegiatan pembiakan patogen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
. Aggregatibacter actinomycetemcomitans yang digunakan adalah spesimen yang telah
dibiakkan secara murni pada media Triptic Soy Agar TSA yang telah disiapkan dalam prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1
– 2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan larutan NaCl 0,9 sampai
diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10
8
CFUml.
3.7.4 Penentuan KHM Bahan Coba
Bahan coba ekstrak kulit buah jeruk nipis yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25. Masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu
dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan
mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks. Lalu tabung-tabung tersebut dibandingkan dengan kontrol untuk
menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi
minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Aggregatibacter actinomycetemcomitans dalam media pembenihan setelah diinkubasi 24 jam
dan tidak tumbuh koloni kuman dalam pembenihan tersebut.
3.7.5 Penentuan KBM Bahan Coba
Setelah KHM didapatkan, maka penelitian dilanjutkan dengan penentuan KBM bahan coba dengan metode Drop Plate Mills Mesra. Bahan coba dengan konsentrasi 100, 50,
25, 12,5 dan 6,25 masing-masing divorteks dan diambil 50 µl lalu diteteskan ke dalam media padat Tryptic Soy Agar direplikasi 6 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai
mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37
o
C selama 24 jam. Perhitungan jumlah koloni bakteri dilakukan dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada
media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni
Universitas Sumatera Utara
melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan
suspensi. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat
jumlah reratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena itu, konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal
sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan
harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.
Gambar 7: a. Koloni bakteri pada konsenterasi 12,5 b. Koloni bakteri pada
konsenterasi 6,25, c. Koloni bakteri pada konsenterasi 3,125
a b
Koloni bakteri
c
Universitas Sumatera Utara
3.8 Skema Alur Penelitian
3.9 Analisis Data
Data hasil pengujian antibakteri dianalisis dengan menggunakan uji statistik sebagai berikut: Uji analisis varian satu arah ANOVA, untuk melihat perbedaan efek antibakteri
ekstrak etanol
kulit jeruk
nipis terhadap
pertumbuhan Aggregatibacter
actinomycetemcomitans. Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk
Nipis Pembuatan Media Bakteri
Pembiakan Spesimen
Penentuan KHM Bahan Coba
Penentuan KBM Bahan Coba
Analisis Data
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL PENELITIAN
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratorium dengan rancangan penelitian posttest only control group design yang dilakukan di dua laboratorium yaitu di
Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU untuk mengekstrak kulit buah jeruk nipis dan di Laboratorium Pusat Penyakit Tropis Universitas Airlangga, Surabaya.
Tabel 3. Hasil ekstrak kulit jeruk nipis Citrus aurantifolia Chrism. Swingle
Pada Tabel 3 terlihat hasil ekstrak kulit jeruk nipis sebanyak 25 gram yang diperoleh setelah melalui proses dan prosedur yang dikontrol selama lima hari di dalam Laboratorium
Obat Tradisional. Etanol 96 digunakan dalam proses ini untuk melarutkan komponen flavonoid dan saponin yang juga bersifat polar. Komponen-komponen lain yang non-polar
tidak akan dilarutkan. Pada penelitian ini digunakan 5 perlakuan yaitu ekstrak kulit jeruk nipis dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, dan 6,25 sebagai variabel bebas untuk
mendapatkan konsenterasi minimal ekstrak kulit buah jeruk nipis yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
Hasil penelitian tersebut menunjukan Kadar Hambat Minimum KHM adalah dapat dilihat pada suspensi bakteri yang jernih. Pada penelitian ini, kekeruhan bahan coba di dalam
tabung tidak berubah sehingga dianggap tidak representatif untuk mengukur nilai Kadar Hambat Minimum KHM. Oleh karena itu, nilai KHM tidak dapat ditentukan. Pada Tabel 4
didapatkan bahwa ekstrak kulit jeruk nipis pada konsenterasi berbeda memiliki daya hambat yang berbeda terhadap pertumbuhan bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Kadar
Berat Jeruk Nipis g Hasil Ekstrak Kulit
Jeruk Nipis g
2000 25
Universitas Sumatera Utara
