dan ditepatkan menjadi 2 x 10
6
sel ml. Setelah itu ditambahkan serum darah AB sebanyak 10 .
Suspensi sel yang diambil Lapisan buffycoat
Sel darah merah
Gambar 7. Hasil pemisahan sel darah manusia N = A x FP x 10
4
sel ml Keterangan :N
= jumlah sel limfosit ml A
= jumlah sel hidup rata-rata per diagonal haemacytometer
FP = faktor Pengenceran
2. Tahap Analisis Kimia
Analisis kimia yang dilakukan adalah analisis kadar air, kadar protein, kadar total fenol, dan kapasitas antioksidan. Pengujian kadar air
dan kadar protein dilakukan menggunakan bahan segar tanaman. Kelima tanaman tanpa melalui proses ekstraksi, dianalisis kadar air dan kadar
protein menggunakan metode yang sudah ditentukan. Pengujian kadar total fenol dan kapasitas antioksidan dilakukan menggunakan ekstrak
kelima tanaman.
2.1. Analisis kadar air metode oven AOAC,1984 Cawan aluminium dikeringkan dalam oven selama 15 menit
dan didinginkan dalam desikator selama 10 menit, kemudian ditimbang. Kelima tanaman daun delima putih, daun kemuning, daun
jati belanda, daun ceremai, dan bunga kecombrang dipotong kecil- kecil kemudian ditimbang kurang lebih 5 gram dalam cawan.
Selanjutnya cawan beserta isinya ditempatkan dalam oven selama 6 jam. Kemudian cawan dipindahkan ke desikator, lalu didinginkan.
Setelah dingin ditimbang kembali dan diulang proses pengeringan dalam oven sampai diperoleh berat yang tetap.
Kadar air diperoleh dengan perhitungan sebagai berikut :
Keterangan : a = berat cawan dan sampel akhir g b = barat cawan g
c = berat sampel awal g
2.2. Analisis kadar protein AOAC,1984 Masing-masing tanaman daun delima putih, daun
kemuning, daun jati belanda, daun ceremai, dan bunga kecombrang ditimbang 0.1-0.15 gram. Setelah itu dimasukkan masing-masing ke
dalam labu Kjeldahl dan ditambahkan 1.9±0.1 g K
2
SO
4
, 40±10 mg HgO, dan 2.0±0.1 ml H
2
SO
4
. Contoh kemudian dididihkan sampai cairan menjadi jernih sekitar 1 jam. Larutan jernih ini kemudian
dipindahkan ke alat destilasi. Labu Kjeldahl dicuci dengan air 1-2 ml. Air cucian dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan
10 ml larutan NaOH-Na
2
S
2
O
3
. Digunakan asam standar yaitu asam borat yang telah ditambahkan indikator campuran merah metil dan
metil biru. Destilasi dihentikan saat terjadi perubahan warna asam Kadar air bb : c – a-b x 100
c Kadar air bk : c – a-b x 100
a-b
standar dari biru violet menjadi hijau. Cairan hasil destilasi dalam erlenmeyer kemudian dititrasi oleh HCl 0.02 N. Titik akhir titrasi
ketika warna titrat berubah dari hijau menjadi biru keunguanabu- abu.
Kadar protein diperoleh dengan perhitungan sebagai berikut :
2.3. Analisis Total Fenol Analisis terhadap total fenol kelima ekstrak tanaman
dilakukan menurut metode Chandler dan Dodds yang dimodifikasi Shetty et.al , 1995. Sebanyak 1 ml ekstrak tanaman daun delima
putih, daun kemuning, daun jati belanda, daun ceremai, dan bunga kecombrangmasing-masing diencerkan dengan perbandingan 1:100.
Kemudian sebanyak 1 ml masing-masing ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 1 ml etanol 95 dan 5 ml air
bebas ion. Pereaksi Folin-Ciocalteceau 50, 0,5 ml ditambahkan pada masing-masing sampel. Campuran tersebut kemudian divorteks
dan didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit, ditambahkan 1 ml Na
2
CO
3
5 , kemudian divorteks dan disimpan selama 60 menit dalam ruang gelap. Sampel dihomogenisasi kembali, dan
absorbansinya diukur pada panjang gelombang 725 nm. Standar yang digunakan adalah asam tanat. Dengan konsentrasi 0,5,10,15,20,
dan 25 ppm. 2.4. Pengujian Kemampuan Antioksidan untuk Meredam Radikal Bebas
Kapasitas Antioksidan Hatano, et.al,1988 Analisis kapasitas antioksidan dilakukan dengan
menggunakan metode DPPH. Sebanyak 2 ml buffer asetat dicampur N = ml HCL sampel – ml HCL blanko x N HCL x 14.007 x 100
mg contoh Kadar Protein KP = Faktor Konversi x N
dengan 3.75 ml metanol dan 200 μl larutan DPPH. Campuran
kemudian divorteks. Setelah itu ditambahkan masing-masing 50 μl
ekstrak tanaman daun delima putih, daun kemuning, daun jati belanda, daun ceremai, dan bunga kecombrang atau kontrol standar
atau kontrol positif. Larutan kemudian divorteks dan didiamkan selama 20 menit di ruang gelap. Absorbansi larutan diukur pada
panjang gelombang 517 nm. Kontrol standar yang digunakan adalah metanol, sedangkan kontrol positif yang digunakan adalah adalah
asam askorbat dengan konsentrasi 50 , 100 , 200 , 500 , dan 1000 ppm. Kapasitas antioksidan diperoleh dengan perhitungan sebagai
berikut : Kapasitas antioksidan : [ A kontrol - – A sampel ] x 100
A kontrol - Antioksidan yang terdapat pada ekstrak tanaman selain
dinyatakan dengan persen kapasitas antioksidan, dinyatakan juga dalam bentuk AEAC Ascorbic acid Equivalent Antioxidant
Capacity. Dibuat kurva standar asam askorbat dengan perbandingan antara kapasitas antioksidan dan konsentrasi asam askorbat
ppm. Ascorbic acid Equivalent Antioxidant Capacity AEAC ekstrak ditentukan menggunakan persamaan kurva standar asam
askorbat yang diperoleh, dan dinyatakan dalam mg l AEAC.
3. Pengujian Toksisitas dan Daya Imunomodulator Ekstrak Kelima Tanaman Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Manusia
3.1 Persiapan ekstrak kelima tanaman untuk kultur sel Ekstrak yang digunakan untuk pengujian toksisitas dan
daya imunomodulator diencerkan pada tiga taraf konsentrasi dengan media RPMI-1640 sebagai media pelarut, kemudian disterilisasi
dengan membran 0.22 μm. Tiga taraf konsentrasi itu adalah C1, C2,
dan C3. C1 adalah setengah konsentrasi dari konsumsi normal, C2 adalah konsentrasi pada konsumsi normal, dan C3 adalah dua kali
konsentrasi normal masyarakat. Konsentrasi normal ekstrak tanaman yang diujikan dapat dilihat pada Tabel 11
3.2. Metode biru tripan Meiriana, 2006 Pada masing-masing sumur ditambahkan sebanyak 20
μl ekstrak dengan tiga taraf konsentrasi dan suspensi sel sebanyak 80
μl suspensi sel telah ditambahkan 10 serum terlebih dahulu. Sebagai
kontrol standar, ke dalam setiap sumur dimasukkan suspensi sel sebanyak 80
μl dan 20 μl RPMI. Untuk kontrol positif, tiap sumur dimasukkan 80
μl suspensi sel dan 20 μl mitogen Con A atau LPS. Konsentrasi mitogen yang digunakan adalah 10
μg mitogen μl RPMI-1640. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C 5 CO
2
, 95 O
2
dan RH 96 selama 72 jam. Pengukuran jumlah sel mati dihitung dengan bantuan pewarnaan biru tripan menggunakan
haemocytometer. 3.3. Metode MTT Meiriana, 2006
Langkah-langkah yang dilakukan sama dengan metode biru tripan, hanya saja 4 jam sebelum masa inkubasi berakhir, kultur sel
ditambahkan 10 μl larutan MTT 0.5 . Setelah masa inkubasi
berakhir, pada masing-masing sumur kultur sel, ditambahkan dengan 100
μl HCL-Isopropanol 0.04 N untuk melarutkan kristal formazan yang terbentuk. Setelah itu dilakukan pengukuran absorbansi pada
panjang gelombang 570 nm menggunakan Spectrophotometer Microplate Reader. Nilai absorbansi yang terbaca bersifat
proporsional terhadap jumlah sel yang hidup. Indeks Stimulasi I.S dihitung menggunakan persamaan berikut :
IS = Absorbansi sampelAbsorbansi kontrol x 100
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 1.
Ekstraksi
Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi terhadap lima tanaman yaitu kemuning, ceremai, delima putih, jati belanda, dan kecombrang. Untuk
kemuning, delima putih, jati belanda, dan ceremai, bagian yang diekstrak adalah daun, sedangkan bagian yang diekstrak dari kecombrang adalah bunga.
Pemilihan bagian tanaman tersebut berdasarkan pemanfaatan bagian tanaman secara tradisional oleh masyarakat.
Ekstraksi adalah metode pemisahan dimana komponen-komponen terlarut dari suatu campuran dipisahkan dari komponen-komponen yang tidak
larut dengan pelarut yang sesuai Leniger dan Beverloo, 1975. Metode paling sederhana untuk mengekstraksi padatan adalah dengan mencampur seluruh
bahan dengan pelarut, lalu memisahkan larutan dengan padatan tidak terlarut. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi pada penelitian ini adalah aquades dan
etanol 96 . Ekstrak dengan pelarut aquades digunakan sebagai pendekatan
terhadap keadaan nyata konsumsi tanaman tersebut sehari-hari secara umum, karena secara tradisional pengkonsumsian kelima tanaman tersebut
menggunakan pelarut air. Pelarut etanol digunakan karena memiliki polaritas lebih tinggi daripada aquades sehingga akan lebih banyak melarutkan
komponen polar. Etanol mudah untuk melarutkan senyawa resin, lemak, minyak, asam lemak, dan senyawa organik lainnya, serta merupakan pelarut
yang aman dalam arti tidak toksik Somaatmaja, 1981, selain itu untuk mengekstrak suatu bahan yang belum diketahui kandungan kimianya secara
jelas diharuskan menggunakan pelarut etanol atau air untuk alasan keamanan DepKes, 2000.
Penelitian lain yang telah dilakukan dengan menggunakan pelarut aquades dan etanol 96 telah dilakukan oleh Nora 2003
. Ekstrak tanaman
yang digunakan adalah daun kumis kucing dan bunga kenop. Perbandingan antara jumlah tanaman dan pelarut pada saat ekstraksi berdasarkan konsumsi
normal masyarakat. Hasil ekstraksi kemudian diujikan pada sel limfosit tikus
