29
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk dalam ekperimental murni rancangan acak lengkap pola searah.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel Utama
1 Variabel bebas : konsentrasi ekstrak etanol daun Trengguli
2 Variabel tergantung : tebal edema kulit punggung mencit mm
b. Variabel Pengacau
1 Variabel pengacau terkendali :
a Subyek uji
: mencit betina galur Swiss b
Umur subyek uji : 2-3 bulan
c Berat badan
: 20-25 gram 2
Variabel pengacau tak terkendali : kondisi patofisiologis hewan uji mencit yang digunakan dalam penelitian
2. Definisi operasional
a. Daun C. fistula yang digunakan merupakan daun berwarna hijau dan tidak
berlubang, daun diambil pada pagi hari di lingkungan Universitas Sanata Dharma Kampus III Paingan.
b. Ekstrak C. fistula adalah ekstak yang didapatkan dari proses maserasi 25
gram serbuk kering daun C. fistula dalam pelarut 250 mL etanol 80 selama 5 hari yang kemudian dimaserasi kembali dengan jumlah pelarut
yang sama selama 2 hari. Ekstrak cair yang didapatkan diuapkan hingga
didapatkan ekstrak kental.
c. Konsentrasi ekstrak C. fistula yang digunakan adalah 1,67; 2,5; dan 3,75
bb dalam basis dengan satuan gram.
d. Ekstrak C. fistula diberikan secara topikal, yaitu dengan dioleskan di atas
kulit punggung mencit yang telah diinjeksikan karagenin 3.
e. Respon inflamasi yang diamati berupa tebal edema yang timbul pada kulit
punggung mencit.
f. Tebal edema diamati dengan mengukur tebal lipatan kulit punggung
mencit setelah diinjeksikan karagenin 3 setiap 1 jam selama 6 jam pengamatan. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan jangka sorong
digital Widyarini, Spinks, Husband, and Reeve, 2001.
g. Efek antiinflamasi ekstrak daun C. fistula adalah kemampuan ekstrak daun
C. fistula untuk mengurangi tebal edema kulit punggung mencit yang
terinduksi karagenin.
h. Karagenin diberikan sebagi agen pemicu inflamasi secara injeksi subkutan,
yaitu injeksi yang dilakukan pada jaringan di bawah permukaan kulit.
C. Bahan Penelitian
1. Hewan uji yang digunakan , yaitu mencit betina galur Swiss yang berumur 2-3
bulan dengan berat badan 20-30 gram yang diperoleh dari Laboratorium
Hayati Imono USD Yogyakarta.
2. Bahan uji yang digunakan adalah daun Cassia fistula Linn. Yang diperoleh
dari lingkungan Universitas Sanata Dharma Kampus III Paingan.
3. Zat inflamatogen yang digunakan adalah karagenin tipe I Sigma
®
yang
diperoleh dari Fakultas Farmasi Universitas Islam Indonesia.
4.
Etanol 80 digunakan sebagai pelarut ekstrak dibeli dari Brataco.
5. Hydrocortisone
®
cream sebagai kontrol positif.
6. Biocream
®
sebagai basis krim.
7. Veet
®
cream untuk membantu merontokkan bulu puggung mencit.
8. Larutan fisiologi NaCl 0,9 sebagai pelarut karagenin dibeli dari Apotek K24
Condong Catur. D.
Alat Penelitian 1.
Alat pembuatan ekstrak kental
a. Oven
b. Mesin penyerbuk
c. Alat-alat gelas glass beaker, Erlenmeyer, gelas ukur, cawan porselen,
pipet tetes, batang pengaduk.
2. Alat penginduksi dan pengukur edema kulit punggung mencit
a. Spuit injeksi
b. Jangka sorong digital
3. Lain-lain
a. Neraca analitik
b. Gunting
c. Alat pencukur bulu
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman dilakukan menggunakan ciri-ciri tanaman Cassia fistula
L. sesuai dengan acuan Steenis, Hoed, dan Eyma 1992..
2. Pengumpulan bahan
Daun dipanen dan kumpulkan pada pagi hari dari pohon C. fistula yang terdapat di wilayah Kampus III Universitas Sanata Dharma Paingan.
3. Pembuatan simplisia
Daun C. fistula yang telah dikumpulkan dipilah terlebih dahulu dan diambil daun yang tidak terlalu tua atau terlalu muda, dan tidak berlubang,
kemudian dicuci dengan air bersih mengalir. Setelah itu daun dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 30°-45°C hingga daun benar-benar kering.
Suhu tersebut sudah sesuai dengan Anonim 2009 yang menyebutkan bahwa bahan alam dikeringkan dengan suhu pengeringan tidak lebih dari 60°C.
Selanjutnya daun kering C. fistula dipotong dan dihaluskan. Serbuk halus kemudian diayak menggunakan ayakan dengan nomor mesh 40, kemudian
ditimbang sebanyak 25 g.
4. Pembuatan ekstrak
Ekstrak didapatkan dengan proses maserasi, serbuk kering daun trengguli direndam dalam 250 mL etanol 80 dalam Erlenmeyer 500 mL selama 5
hari pada suhu kamar dilakukan pengadukan selama proses maserasi menggunakan shaker. Setelah itu ampas dan filtrat dipisahkan kemudian
ampas dimaserasi kembali dengan 250 mL etanol 80 selama 2 hari. Selanjutnya filtrat diuapkan menggunakan rotary evaporator dengan suhu
40° C dan dilanjutkan dengan water-bath pada suhu 40-50° C hingga didapatkan ekstrak kental. Selanjutnya ekstrak ditutup rapat dan disimpan
dalam lemari pendingin hingga waktu penggunaan.
5. Pembuatan krim ektrak etanol daun C. fistula L. 1,67; 2,5; 3,75 BB
Krim ekstrak etanol konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75 BB didapatkan dengan menimbang 0,167; 0,25; dan 0,375 gram ekstrak kental C. fistula L.
kemudian dicampurkan ke dalam 10 gram Biocream
®
.
6. Pembuatan larutan karagenin 3
Larutan karagenin 3 dibuat dengan melarutkan 3 gram karagenin dalam 100 mL larutan fisiologis NaCl 0,9.
7. Pengujian dengan krim ekstrak daun C. fistula
Sebanyak 30 ekor mencit berumur 2-3 bulan dan berat badan 20-25 g dipilih secara acak dan dibagi menjadi 6 kelompok perlakuan. Bagian
punggung mencit dicukur bulunya dilanjutkan dengan pengolesan Feet
®
agar area cukut lebih rapi. Setelah itu mencit didiamkan selama satu hari. Keesokan
harinya dilakukan pengukuran tebal lipat kulit punggung pada jam ke-0, kemudian diinjeksi karagenin 3 sebanyak 0,2 mL dan diukur tebal edemanya
menggunakan jangka sorong setiap jam selama 6 jam. Pengolesan krim dilakukan sesaat setelah dilakukan injeksi karagenin. Kelompok pertama
kontrol negatif hanya diinjeksikan dengan karagenin saja. Kelompok kedua kontrol
positif diinjeksikan
karagenin kemudian
dioleskan krim
Hydrocortisone
®
. Kelompok ketiga kontrol Biocream
®
diinjeksikan karagenin kemudian dioleskan Biocream
®
. Selanjutnya kelompok 4, 5, dan 6 kelompok perlakuan diinjeksikan karagenin kemudian dioleskan krim
ekstrak C. fistula dengan konsentrasi berturut-turut 1,67; 2,5; 3,75 BB. Pengolesan krim dilakukan pada luas permukaan punggung mencit terinduksi
karagenin seluas 2,25 cm
2
1,5 cm x 1,5 cm.
F. Tata Cara Analisis Hasil
1. Analisis hasil dilakukan dengan mengukur ketebalan edema kulit punggung
mencit yang diukur menggunakan jangka sorong digital. 2.
Nilai selisih edema tiap jam diukur dan dihitung nilai AUC total masing- masing perlakuan dengan rumus :
∑ [ ]
Keterangan : AUC
0-6
= area di bawah kurva dari jam ke-0 sampai jam ke-6 cm
2
.jam = luas area pigmentase pada jam ke-n-1cm
2
= luas area pigmentase pada jam ke-n cm
2
= jam ke-n jam = jam ke-n-1 jam
Ikawati, Supardjan, dan Asmara, 2007. 3.
Menghitung presentase penghambatan inflamasi
Keterangan : =
rata-rata kontrol negatif mm.jam =
masing-masing mencit pada kelompok yang diberi senyawa uji dengan konsentrasi sebesar n
mm.jam Ikawati, Supardjan, dan Asmara, 2007.
4. Persen penghambatan inflamasi masing-masing perlakuan kemudian dianalisis
menggunakan uji Shapiro-Wilk untuk melihat distribusi data. Jika data terdistribusi secara normal maka dilanjutkan dengan analisis Anova dengan
taraf kepercayaan 95, jika data tidak terdistribusi normal maka dilanjutkan dengan analisis Kruskall-Wallis. Apabila uji Kruskall-Wallis menunjukkan
paling tidak terdapat perbedaan antara dua kelompok, maka dilanjutkan dengan analisis Post hoc Mann-Whitney Dahlan, 2014.
36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Cassia fistula L. yang didapatkan dari lingkungan Universitas Sanata Dharma Kampus III Paingan.
Tanaman C. fistula dideterminasi untuk memastikan kebenaran tanaman yang akan diteliti apakah daun yang digunakan dalam penelitian adalah benar
merupakan daun dari tanaman C. fistula atau trengguli. Determinasi dilakukan dengan pengamatan bagian daun, bunga, dan buah. Determinasi dilaksanakan di
Laboratoriun Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Sanata Dharma berdasarkan acuan Steenis, Hoed, dan Eyma 1992 hingga kategori jenis species. Hasil
determinasi menunjukka bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar merupakan tanaman Cassia fistula L Lampiran 1.
B. Ekstrak Etanol Daun C. fistula
Ekstrak etanol daun C. fistula yang digunakan dalam penelitian merupakan ekstrak kental yang diperoleh melalui proses maserasi. Maserasi merupakan
prosedur ekstraksi yang mudah dan secara luas digunakan. Maserasi pada umumnya dilakukan pada suhu ruang dengan merendam simplisia dalam pelarut
selama beberapa hari dengan pengadukan secara berkala. Proses perendaman ini diulang 1-2 kali dengan pelarut yang baru Mahdi dan Altikriti, 2010. Daun
C. fistula diambil dari lingkungan sekitar kampus III Sanata Dharma pada pukul