28
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Bahan dan Alat
1. Bahan-bahan yang digunakan adalah lemak kakao UKM, Malaysia, minyak kelapa dibuat secara tradisional dan minyak kemiri press mekanik, enzim
yang diisolasi dari biji sawit PPKS, Medan, biji kemiri pasar tradisional, Medan dan biji kakao perkebunan rakyat, Medan, katalis kimia NaOCH
3
, enzim komersial Lipozyme®TL IM dan bahan-bahan kimia dari produk E-
merk. 2.
Peralatan yang digunakan seperti alat-alat gelas, sentrifus, hot plate stirrer,
blender, termometer, termostat, batang pengaduk, GC jenis Shimadzu GC- 14B, Japan, dengan menggunakan kolom kaca fasa diam dan fasa pendukung
kromosom weigh, detector FID, integrator cromatopac C-R5 A, suhu kolom 180
o
C, suhu injector 220
o
C dan suhu detector 230
o
C, pulsa NMR tipe BS- 684.
Penelitian dilakukan di laboratorium Kimia Organik, laboratorium biokimia, Universitas Sumatera Utara USU, Laboratorium University Kebangsaan
Malaysia UKM, Selangor, Malaysia dan laboratorium salah satu perusahaan swasta di Medan.
3.2 Metode 3.2.1 Isolasi Enzim
Ada 3 jenis enzim yang diisolasi yaitu enzim dari biji sawit, biji kemiri dan biji kakao.
Preparasi enzim
Preparasi enzim dari biji sawit, biji kemiri, da biji kakao masing-masing dilakukan pada t=4
C dalam termostat, biji dicuci dengan air destilata dan
Universitas Sumatera Utara
29 dihomogenkan selama 10 menit pada medium yang mengandung 0.6 M sukrosa, 1
mM EDTA, 10 mM KCl, 1 mM MgCl
2
, 2 mM DTT dan 0.15 M tricine N- trishydroxymethyl methyl-glycine kemudian di blender dan pH diatur 7.5
dengan penambahan KOH, setelah itu disentrifus selama 30 menit pada kecepatan 10.000 rpm Abigor, et.al., 2002. Lapisan supernatan digunakan untuk pemurnian
enzim. Proses pemurnian enzim dilakukan menggunakan garam ammonium sulfat.
Penambahan amonium sulfat dilakukan sampai terbentuk endapan maksimal. Pengendapan dengan amonium sulfat dilakukan dengan cara menambahkan
amonium sulfat sedikit demi sedikit pada larutan ekstrak kasar enzim sambil diaduk dengan pengaduk magnet. Pengadukan diusahakan sedemikian rupa
sehingga tidak menimbulkan busa selama kurang lebih 20 menit. Setiap endapan protein enzim yang didapat dipisahkan dari filtratnya dengan menggunakan
sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit kemudian dilarutkan dalam larutan buffer fosfat pH 7.5 dengan konsentrasi 0,05M lalu diuji
aktivitasnya menggunakan metode titrimetri Handayani dan Sulistyo, 2005,
Nurhasanah dan Herasari, 2008.
3.2.2 Penentuan Aktivitas Lipase
Aktivitas Lipase ditentukan terhadap 3 macam enzim dan 3 macam substrat yaitu:
a. Aktivitas lipase inti sawit dengan substrat minyak kelapa, minyak
kemiri dan lemak kakao
Aktifitas lipase inti sawit dilakukan dengan metode titrimetri Handayani dan Sulistyo, 2005. Sebanyak 20 mL minyak kelapa dan 470
µL larutan 0.5 M CaCl
2
dicampurkan dan dihomogenkan pada t= 30
o
C dan diaduk dengan magnetik stirer selama 5 menit. Dalam campuran
ditambahkan 1 mg enzim dan diaduk kembali selama 20 menit. Setelah itu enzim
dinonaktifkan dengan
campuran aseton:etil
asetat 1:1.
Ditambahkan 3 tetes phenolpthalein sebagai indikator, kemudian dititrasi dengan 0.05 N NaOH standar. Blanko dilakukan dengan mentitrasi 20 ml
campuran aseton:etil asetat.
Universitas Sumatera Utara
30 Aktivitas lipase dihitung dengan rumus:
Aktivitas enzim per mg = V x N x 1000 t
V = volume NaOH yang dipakai mL N = normalitas NaOH N
t= waktu menit Aktivitas enzim = IU International Unit yaitu enzim yang
mengkatalisis pembentukan 1µ mol produk per menit.
Penentuan aktivitas lipase inti sawit terhadap substrat minyak kemiri dan lemak kakao dilakukan hal sama seperti yang diatas.
b. Untuk menentukan aktivitas lipase dari biji kemiri dan biji kakao terhadap
substrat minyak kelapa, minyak kemiri dan lemak kakao juga dilakukan seperti lipase inti sawit.
3.2.3 Penentuan Komposisi Asam Lemak
3.2.3.1 Lemak kakao
Lemak kakao diperoleh dari University Kebangsaan Malaysia UKM dan ditentukan komposisi asam lemak dengan kromatografi gas GC.
3.2.3.2 Komposisi Minyak Kelapa
Minyak kelapa dibuat secara tradisional dengan memanaskan santan kelapa sebanyak ±2 liter sampai terjadi minyak. Untuk menghilangkan kelebihan air,
minyak kelapa yang dihasilkan dilarutkan dengan n-heksana kemudian dirotari evaporator dan diperoleh residu sebanyak 700 mL. Minyak tersebut dimurnikan
dengan tahapan-tahapan pemurn\ian minyak yaitu penyaringan, degumming,
Universitas Sumatera Utara
31 netralisasi, pemisahan sabun, pemucatan dan deodorisasi Irianto, 2002. lalu
ditentukan komposisi asam lemak dengan kromatografi gas GC.
3.2.3.3 Komposisi Minyak Kemiri
Biji kemiri sebanyak 1 kg, dipress untuk mengambil minyak, untuk menghilangkan air, minyak yang diperoleh dilarutkan dengan n-heksana,
kemudian dirotari evaporator untuk memperoleh minyak kemiri sebagai residu sebanyak 600 gram. Minyak yang diperoleh kemudian dilakukan proses
pemurnian. Tahapan-tahapan pemurnian minyak yaitu penyaringan, degumming, netralisasi,
pemisahan sabun,
pemucatan dan
deodorisasi Irianto,
2002.kemudian ditentukan komposisi asam lemak dengan GC.
3.2.4 Interesterifikasi 3.2.4.1 Interesterifikasi lemak kakao dengan minyak kelapa
Proses interesterifikasi dilakukan dengan 4 perbandingan yaitu 90:10; 80:20; 70:30; dan 60:40 dan 3 jenis enzim yang diisolasi yaitu lipase inti
sawit, lipase kemiri dan lipase kakao, dan 2 enzim pembanding yaitu lipozyme TL IM dan katalis NaOCH
3
antara lemak kakao dengan minyak kelapa dan dengan minyak kemiri. Perbandingan ini bertujuan untuk mendapatkan rasio terbaik
sebagai pengganti lemak kakao.
3.2.4.1.1 Enzim lipase Lipase inti sawit, lipase kemiri, lipase kakao dan lipozyme TL IM
Kedalam campuran lemak kakao dan minyak kelapa dengan perbandingan 90:10 ditambahkan lipase inti sawit 10 kemudian diaduk pada suhu 40
o
C dan selama 120 menit dengan kecepatan pengaduk 4000 rpm. Enzim
dinonaktifkan dengan penambahan aseton dan etanol 1:1 20 ml, lalu disaring. Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap perbandingan 80:20; 70:30; dan
60:40.
3.2.4.1.2 Katalis kimia NaOCH
3
Universitas Sumatera Utara
32 Kedalam campuran lemak kakao dan minyak kelapa dengan perbandingan
90:10 ditambahkan katalis NaOCH
3
0.3 gram, kemudian diaduk pada suhu 80
o
C dan selama 120 menit dengan kecepatan pengadukan 4000 rpm. Katalis dinonaktifkan dengan menggunakan asam sitrat 20 sebanyak 20 ml, kemudian
dipisahkan dengan corong pisah. Hal yang sama dilakukan terhadap campuran lemak kakao dan minyak kelapa dengan perbandingan masing-masing 80:20;
70:30 dan 60:40.
3.2.4.2 Interesterifikasi lemak kakao dengan minyak kemiri
Proses interesterifikasi lemak kakao dengan minyak kemiri dilakukan hal yang sama baik dengan enzim lipase yaitu lipase inti sawit, lipase kemiri, lipase
kakao dan lipozyme TL IM dan katalis kimia NaOCH
3
. Proses interesterifikasi juga dilakukan dengan 4 perbandingan yang sama yaitu 90:10, 80:20, 70:30,
dan 60:40.
3.2.5 Karakterisasi Hasil Interesterifikasi
Hasil interesterifikasi dari masing-masing reaksi interesterifikasi di atas dikarakterisasi dengan beberapa cara yaitu:
- penentuan kandungan lemak padat SFC - penentuan titik leleh
- penentuan komposisi asam lemak dan asam lemak trans - penentuan komposisi trigliserida TG
- penentuan asam lemak bebas FFA
3.2.5.1 Penentuan kandungan lemak padat SFC
Penentuan SFC dilakukan dengan pulsa NMR pada hasil interesterifikasi lemak kakao dengan minyak kelapa dan dengan minyak kemiri masing-masing
dengan 3 macam enzim dari lipase inti sawit, kemiri dan kakao dan 2 enzim pembanding yaitu lipozyme TL IM dan katalis NaOCH
3
, sedangkan hasil reaksi dibedakan dengan proses blending. Kandungan lemak padat SFC juga
ditentukan dengan empat perbandingan 90:10; 80:20; 70:30; dan 60:40.
Universitas Sumatera Utara
33
3.2.5.1.1 Penentuan SFC dari hasil interesterifikasi lemak kakao dan
minyak kelapa
Dengan lipase inti sawit, lipase kemiri dan lipase kakao
Hasil interesterifikasi lemak kakao dengan minyak kelapa 90:10 yang diperoleh dengan menggunakan lipase inti sawit, dipanaskan pada suhu 70
o
C dalam oven selama 30 menit, kemudian didinginkan dalam water bath pada suhu
20
o
C selama 30 menit. Sampel dibiarkan dalam suhu tersebut, lalu tentukan kandungan lemak padatnya dengan pulsa NMR. Setelah itu, suhu dinaikkan
menjadi 25
o
C, tentukan lagi kandungan lemak padatnya. Hal yang sama dilakukan pada suhu 30
o
C, 35
o
C dan 40
o
C. Untuk hasil interesterifikasi lemak kakao dengan minyak kelapa
menggunakan lipase inti sawit dilakukan hal yang sama untuk campuran dengan perbandingan 80:20; 70:30; dan 60:40 masing-masing pada suhu 25
o
C, 30
o
C, 35
o
C dan 40
o
C. Hal yang sama dilakukan terhadap campuran lemak kakao dengan minyak
kelapa menggunakan lipase kemiri atau lipase kakao dengan 4 perbandingan yaitu 90:10; 80:20; 70:30 dan 60:40 masing-masing pada suhu 20
o
C, 25
o
C, 30
o
C, 35
o
C dan 40
o
C. 3.2.5.1.2
Penentuan SFC dari hasil interesterifikasi lemak kakao dan minyak kemiri
Seperti halnya campuran lemak kakao dengan minyak kelapa, untuk campuran dengan minyak kemiri juga dilakukan hal sama dengan 3 macam enzim
yaitu lipase inti sawit, lipase kemiri dan lipase kakao. Campuran hasil interesterifikasi dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30; dan 60:40
masing-masing suhu 20
o
C, 25
o
C, 30
o
C, 35
o
C dan 40
o
C.
3.2.5.1.3 Penentuan SFC dari enzim lipozyme TL IM dan katalis NaOCH
3
Universitas Sumatera Utara
34 Sebagai pembanding terhadap kandungan SFC hasil interesterifikasi lemak
kakao dengan minyak kelapa dan dengan minyak kemiri menggunakan enzim yang diisolasi dari biji inti sawit, biji kemiri dan biji kakao, hal yang sama dengan
memakai enzim komersial Lipozyme TL IM dan katalis kimia NaOCH
3
sebagai pengganti lipase inti sawit, kemiri, dan kakao.
3.2.5.1.4 Penentuan SFC blending
Untuk melihat pengaruh enzim yang digunakan maka akan dibandingkan dengan proses blending yaitu hanya pencampuran tanpa menggunakan enzim.
Pada proses blending ini akan dilakukan perbandingan yang sama dan dengan suhu yang sama dengan proses interesterifikasi.
3.2.5.2 Penentuan Titik Leleh TL
Titik leleh ditentukan dengan metode pipa kapiler AOAC, 1989, Liu, et.al., 2007. Titik leleh dilakukan terhadap campuran lemak kakao dengan minyak
kelapa dan dengan minyak kemiri, masing-masing dengan 4 perbandingan yaitu 90:10; 80:20; 70:30 dan 60:40 dan 3 enzim yang diisolasi yaitu lipase inti
sawit, lipase kemiri dan lipase kakao dan 2 enzim pembanding yaitu lipozyme TL IM dan NaOCH
3,
hasil titik leleh dibandingkan dengan proses blending.
3.2.5.3 Komposisi asam lemak dan asam lemak trans hasil interesterifikasi dengan berbagai katalis
Sejauh ini, telah ditentukan karakterisasi yaitu SFC dan TL dari hasil interesterifikasi lemak kakao dengan minyak kelapa dan dengan minyak kemiri.
Dari hasil interesterifikasi tersebut ternyata yang memenuhi pengamatan SFC dan TL hanya hasil interesterifikasi dengan campuran 90:10 dan 80:20 oleh karena
itu, komposisi asam lemak yang ditentukan di bawah ini hanyalah hasil interesterifikasi yang memenuhi persyaratan SFC dan TL. Komposisi asam lemak
dan asam lemak trans ditentukan dengan GC. Untuk membandingkan apakah sudah terjadi interesterifikasi antara lemak kakao dengan minyak kelapa dan
dengan minyak kemiri dilihat dari hasil blending.
Universitas Sumatera Utara
35
3.2.5.4 Penentuan Komposisi Trigliserida TG
Penentuan komposisi trigliserida TG dilakukan terhadap hasil
interesterifikasi lemak kakao dengan minyak kelapa dan dengan minyak kemiri menggunakan 3 macam enzim yaitu lipase inti sawit, lipase kemiri, lipase kakao
serta 2 enzim pembanding yaitu lipozyme TL IM dan NaOCH
3
dengan perbandingan 90:10 dan 80:20. Komposisi TG ditentukan dengan GC TG.
3.2.5.5 Penentuan Asam Lemak Bebas FFA 3.2.5.5.1 FFA untuk restrukturisasi lemak kakao dengan minyak kelapa dan
dengan minyak kemiri
Asam lemak bebas untuk hasil interesterifkasi lemak kakao dengan minyak kelapa dan dengan minyak kemiri pada perbandingan 90:10 dan 80:20 dengan
5 jenis enzim yaitu lipase inti sawit, lipase kemiri, lipase kakao, lipozyme TL IM dan katalis NaOCH
3
ditentukan secara titrimetri menggunakan indikator phenolphthalein.
Universitas Sumatera Utara
36 Diagram alir proses interesterifikasi dengan katalis kimia dan lipase dapat
dilihat pada Gambar 3.1 di bawah ini.
- tambah katalis kimiaenzim
- aduk dengan pengaduk magnetik
T=40
o
C lipase80 C NaOCH
3
, 4000 rpm, t=120 menit
Pemisahan katalis kimiaenzim corong pisah
Hasil interesterifikasi interesterifikasi
analisis
endapan filtrat
Asam Lemak
trigliserida Asam lemak
trans
Lemak kakao + Minyak kelapa minyak kemiri
90:10; 80:20; 70:30;60:40
Kandungan Lemak Padat
Titik leleh
Gambar 3.1 Diagram Alir Proses Interesterifikasi Lemak kakao dengan Minyak Kelapa atau Minyak Kemiri dengan Katalis KimiaEnzim
Universitas Sumatera Utara
37
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori