BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimental meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, karakterisasi simplisia, skrining
fitokimia, pembuatan ekstrak, analisis ekstrak dengan kromatografi lapis tipis, isolasi alkaloida dengan metode asam basa, uji kemurnian isolat dan
karakterisasi isolat dengan spektrofotometri ultraviolet serta spektrofotometri inframerah.
3.1. Alat-alat Yang Digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: alat-alat gelas Iwaki Pyrex, blender Philips, eksikator, mikroskop Olympus, neraca
analitik Vibra AJ, neraca kasar Homeline, oven listrik Memmert, penangas air, penguap vakum putar Stuart, seperangkat alat kromatografi
lapis tipis, seperangkat alat penentu kadar air Pyrex, spektrofotometer ultraviolet Shimadzu, spektrofotometer inframerah Shimadzu dan tanur
Nabertherm.
3.2. Bahan-bahan Yang Digunakan
Sampel yang digunakan adalah biji jintan hitam Nigellae sativae semen. Bahan kimia yang digunakan berkualitas proanalisa E.Merck yaitu:
amonia, asam asetat anhidrida, asam klorida, asam nitrat, asam sulfat, benzena,
Universitas Sumatera Utara
besi III klorida, bismuth III nitrat, etanol, etilasetat, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium hidroksida, n-heksan,
α-naftol, plat pra lapis silika gel 60 F
254
, raksa II klorida, serbuk magnesium, timbal II asetat dan toluena. Selain itu juga digunakan air suling.
3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi
Pembuatan larutan pereaksi asam klorida 2 N, asam sulfat 2 N, Bouchardat, kloralhidrat, Mayer, Molish, natrium hidroksida 2 N, timbal II
asetat 0,4 M, Depkes, 1995, besi III klorida 10 Depkes, 1979, Liebermann-Burchard dan Dragendorff Harborne, 1987.
3.3.1 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,359 gram raksa II klorida ditimbang, dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain kalium iodida ditimbang sebanyak 5
gram, dilarutkan dalam 10 ml air suling, kemudian keduanya dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga 100 ml.
3.3.2 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 gram kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling dan sebanyak 2 gram iodium ditimbang, dilarutkan dalam larutan kalium
iodida dan dicukupkan dengan air suling hingga 100 ml.
3.3.3 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,6 gram bismuth III nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 2 ml asam klorida pekat, lalu ditambahkan 10 ml air suling. Pada wadah lain
Universitas Sumatera Utara
dilarutkan 6 gram kalium iodida dalam 10 ml air suling. Kemudian kedua larutan dicampurkan dengan 7 ml asam klorida pekat dan 15 ml air suling.
3.3.4 Pereaksi Liebermann-Burchard
Dua puluh bagian asam asetat anhidrida dicampurkan dengan satu bagian asam sulfat pekat.
3.3.5 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 7,293 ml asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga 100 ml.
3.3.6 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,001 gram kristal natrium hidroksida ditimbang, dilarutkan dalam air suling sehingga diperoleh larutan 100 ml.
3.3.7 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 9,808 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling secukupnya hingga volume 100 ml.
3.3.8 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 gram α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5
N hingga diperoleh larutan 100 ml.
3.3.9 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 gram besi III klorida ditimbang, dilarutkan dalam air suling sehingga diperoleh larutan 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.3.10 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 gram timbal II asetat ditimbang, dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida sehingga diperoleh larutan 100 ml.
3.3.11 Pereaksi kloralhidrat 70
Sebanyak 18 gram kloralhidrat ditimbang, dilarutkan dalam campuran 20 ml air suling.
3.4 Pengambilan dan Pengolahan Sampel 3.4.1 Pengambilan sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji jintan hitam yang dibeli dari Pasar tradisional Pajak Sore Padang Bulan Kecamatan Medan
Baru Medan. Pengambilan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan sampel yang sama dari daerah lain.
3.4.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor hasil identifikasi tumbuhan dapat
dilihat pada Lampiran I.
3.4.3 Pembuatan simplisia
Biji jintan hitam dibersihkan dari pengotoran, dicuci dengan air bersih, ditiriskan dan dikeringkan di udara terbuka diangin-anginkan serta terlindung
dari sinar matahari langsung. Sampel yang telah kering diserbuk dengan blender dan disimpan dalam wadah tertutup rapat.
Universitas Sumatera Utara
3.5 Karakterisasi Simplisia
Karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik simplisia, mikroskopik serbuk simplisia, penetapan kadar abu, penetapan kadar abu tidak
larut dalam asam, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol Depkes, 1995 dan penetapan kadar air WHO,
1998.
3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan cara mengamati bentuk, warna, ukuran dan bau simplisia biji jintan hitam Nigellae sativae semen.
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan dilakukan terhadap serbuk simplisia. Pada kaca objek diletakkan preparat lalu ditetesi dengan larutan kloralhidrat 70, ditutup
dengan kaca penutup diamati di bawah mikroskop.
3.5.3 Penetapan kadar abu
Sebanyak 2 gram serbuk yang telah digerus ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam krus porselen yang telah terlebih dahulu dipijar dan
ditara, kemudian diratakan. Lalu krus dipijarkan perlahan-lahan sampai bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
3.5.4 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijar sampai bobot tetap. Kadar abu yang
Universitas Sumatera Utara
tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
3.5.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 gram serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air
sampai 1 liter menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring.
Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasarkan rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan sampai kering pada suhu
105°C hingga bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
3.5.6 Penetapan kadar sari larut dalam etanol
Sebanyak 5 gram serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol 95 menggunakan labu bersumbat
sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring dengan cepat untuk menghindarkan penguapan dari etanol,
sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan sampai kering pada suhu 105
o
C hingga bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung dalam persen terhadap
bahan yang telah dikeringkan di udara.
3.5.7 Penetapan kadar air
Ke dalam labu alas bulat ditambahkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling, lalu didestilasi selama 2 jam. Toluena didinginkan selama 30 menit dan
Universitas Sumatera Utara
volume air dalam tabung penampung dari alat penentuan kadar air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selanjutnya ke dalam labu dimasukkan 5 gram
bahan sampel yang telah ditimbang seksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mulai mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes
untuk tiap detik. Setelah sebagian besar air terdestilasi, kecepatan tetesan dipercepat menjadi 4 tetes untuk tiap detik dengan cara menaikkan suhu.
Setelah volume air tidak bertambah lagi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung
penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Volume air dibaca setelah air dan toluena memisah sempurna. Selisih kedua volume air yang dibaca
sesuai dengan kandungan air yang terdapat di dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen terhadap berat sampel yang telah dikeringkan.
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia dilakukan berdasarkan Depkes 1995 alkaloida, flavonoida, glikosida, glikosida antrakinon, saponin; Farnsworth 1966 tanin;
dan Harborne 1987 triterpenoidasteroida.
3.6.1 Pemeriksaan alkaloida
Sebanyak 0,5 gram serbuk simplisia ditimbang, kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air
selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut :
− Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
Universitas Sumatera Utara
− Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat − Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan di atas.
3.6.2 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 0,5 gram serbuk simplisia ditimbang, ditambahkan 10 ml metanol, kemudian direfluks selama 10 menit dan disaring panas-panas melalui
kertas saring, filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambahkan n-heksan, dikocok hati-hati lalu didiamkan sebentar. Lapisan
metanol diambil lalu diuapkan pada temperatur 40°C, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etil asetat dan disaring. Filtrat digunakan untuk uji flavonoida dengan cara
sebagai berikut: − Filtrat sebanyak 1 ml diuapkan sampai kering, sisanya dilarutkan dalam 1
ml sampai 2 ml etanol 95 lalu ditambah 0,5 gram serbuk seng dan 2 ml asam klorida 2 N, didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10
tetes asam klorida pekat, jika dalam waktu 2 sampai 5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoida.
− Filtrat sebanyak 1 ml diuapkan sampai kering, sisanya dilarutkan dalam etanol 95 kemudian ditambahkan 0,1 gram serbuk magnesium dan 10
tetes asam klorida pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoida.
Universitas Sumatera Utara
3.6.3 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 gram serbuk simplisia ditimbang, disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 95 dan 3 bagian air suling, ditambahkan
dengan asam klorida 2 N hingga pH larutan 2, direfluks selama 10 menit, dinginkan dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25
ml timbal II asetat 0,4 M dikocok dan didiamkam selama 5 menit, lalu disaring. Filtrat diekstraksi dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2
bagian isopropanol, ini dilakukan sebanyak tiga kali. Kumpulan sari diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50°C. sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol.
Larutan ini digunakan untuk percobaan berikut: larutan sisa dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diuapkan di atas penangas air, sisanya ditambahkan 2 ml
air dan 5 tetes pereaksi Molish kemudian ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Jika terbentuk cincin ungu pada batas
kedua cairan menunjukkan adanya gula.
3.6.4 Pemeriksaan glikosida antrakinon
Sebanyak 0,2 gram serbuk simplisia ditimbang, ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, didinginkan. Ditambahkan 10 ml benzena,
dikocok dan didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring. Lapisan benzena dikocok dengan 2 ml natrium hidroksida 2 N dan didiamkan. Jika
lapisan air berwarna merah intensif dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya glikosida antrakinon.
Universitas Sumatera Utara
3.6.5 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 gram serbuk simplisia ditimbang, disari dengan 10 ml air suling selama 15 menit lalu disaring. Filtratnya diencerkan dengan air suling
sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes larutan pereaksi besi III klorida 1 . Apabila terjadi warna biru atau
hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.
3.6.6 Pemeriksaan triterpenoidasteroida
Sebanyak 1 gram serbuk simplisia ditimbang, direndam dengan 20 ml n-heksana selama 2 jam kemudian disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan
penguap. Pada sisanya ditambahkan pereaksi asam asetat anhidrida 3 tetes dan 3 tetes asam sulfat pekat Liebermann-Burchard. Timbulnya warna ungu atau
merah yang kemudian berubah menjadi hijau biru menunjukkan adanya triterpenoidasteroida.
3.6.7 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 gram serbuk simplisia ditimbang, dimasukkan dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok
kuat-kuat selama 10 detik, jika terbentuk buih yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm dan dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2
N buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin.
3.7 Pembuatan Ekstrak
Senyawa alkaloida diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut metanol.
Universitas Sumatera Utara
Cara kerja: Serbuk simplisia sebanyak 1 kg dimasukkan ke dalam wadah kaca
berwarna, lalu ditambahkan pelarut metanol secukupnya sampai serbuk simplisia basah, didiamkan beberapa jam. Setelah itu ditambahkan pelarut
metanol sampai bahan tumbuhan terendam sempurna. Maserasi dilakukan selama tiga hari sambil sekali-kali diaduk, kemudian dipisahkan sehingga
diperoleh maserat. Ampas bahan tumbuhan ditambahkan pelarut metanol sampai bahan tumbuhan terendam sempurna. Proses maserasi dilakukan tiga
kali masing-masing selama tiga hari sambil sekali-kali diaduk. Semua maserat yang diperoleh digabung, kemudian pelarutnya diuapkan dengan bantuan alat
rotary evaporator suhu tidak lebih dari 40°C, selanjutnya di Freeze dryer, hasilnya diperoleh ekstrak kental Adams, et al., 1970.
Terhadap ekstrak metanol dilakukan skrining fitokimia senyawa alkaloida, flavonoida, glikosida, glikosida antrakinon, tanin, saponin dan
steroidatriterpenoida.
3.8 Isolasi Senyawa Alkaloida dari Ekstrak Metanol dengan Metode Asam Basa
Kategori