23
4. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Labu erlenmeyer, jarum ose, shaker Labortechnik
®
, LAF cabinet Labconco
®
, tabung reaksi Pyrex
®
, gelas ukur, 5.
Pengecatan Gram dan Pemisahan Koloni Bakteri Kertas label, handscoon, masker, jarum ose, object glass, degglass,
tabung reaksi, bunsen burner, mikroskop Olympus CX-21
®
, pipet tetes, spidol, cawan petri.
6. Uji Aktivitas Antibakteri
Tabung reaksi Pyrex
®
, rak tabung reaksi, cawan petri, ose, yellow tip, 1 set mikro pipet digital 10µ L-100µ L Masterpette
®
, bunsen burner, gelas ukur,, pelubang gabus, autoklaf, Laminar Air Flow LAF cabinet
Labconco
®
, inkubator, jangka sorong digital Bdq
®
. Labu erlenmeyer, jarum ose, shaker Labortechnik
®
.
C. Bahan yang Digunakan
1. Bahan Utama
Biji buah pepaya matang Carica papaya Linn yang diperoleh dari pedagang buah di Pasar Gede, Surakarta.
2. Cairan Penyari
Etanol 70 teknis 3.
Bakteri Uji Hasil isolasi bakteri dari apusan plak gigi.
commit to user
24
4. Pengambilan Apusan dan Isolasi Bakteri
Alkohol 70, akuades steril, larutan garam fisiologis NaCl 0,9 steril, Media NA Nutrient Agar Merck
®
dan media agar darah steril. 5.
Pembuatan Stok Bakteri Media NA Nutrient Agar steril, akuades.
6. Pengecatan Gram
Bakteri yang diambil dari koloni apusan plak, cat gram A, cat gram B, cat gram C, cat gram D, tissue, kapas.
7. Uji Aktivitas Antibakteri
Media MHA Mueller Hinton Agar Merck
®
, akuades steril, etanol 70, larutan CMC 0,1, larutan amoksisilin 0,03
, kapas, Media NB
Nutrient Broth Merck
®
steril, akuades.
D. Waktu dan Tempat Penelitian
1. Waktu
Penelitian ini dilakukan pada Mei – Agustus 2012
2. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biologi Pusat Sub Lab Mikrobiologi UNS dan Laboratorium Teknologi Farmasi FMIPA UNS.
commit to user
25
E. Tahapan Pelaksanaan Penelitian
Tahapan pelaksanaan penelitian ini meliputi determinasi dan preparasi sampel, pembuatan ekstrak, penyiapan alat dan pembuatan media, pengambilan
apusan plak gigi, isolasi bakteri apusan plak gigi dan pengecatan gram serta uji aktivitas antibakteri secara in vitro.
1. Determinasi dan Preparasi Sampel biji buah pepaya
Langkah ini bertujuan untuk memastikan kebenaran sampel biji buah papaya Carica papaya Linn, dengan mencocokkan ciri-ciri morfologis yang
ada pada biji buah dan tanaman papaya Carica papaya Linn terhadap kepustakaan,yakni buku Flora, yang dibuktikan oleh Lembaga Penelitian dan
Pengabdian Masyarakat LPPM Universitas Setia Budi, Mojosongo- Surakarta.
Biji buah pepaya matang yang telah dipisahkan dari bagian buah lainnya sortasi basah kemudian diambil dicuci di bawah air mengalir,
ditiriskan dan dikeringkan. Pengeringan dapat dilakukan dengan dijemur di bawah sinar matahari dan dilapisi dengan kain hitam atau dioven pada suhu
30-50ºC. Simplisia dipisahkan dari pengotor-pengotor sortasi kering. Simplisia biji buah pepaya selanjutnya dihaluskan dan diayak menggunakan
ayakan nomor 4060. 2.
Ekstraksi Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi yakni serbuk
simplisia biji pepaya sebanyak 700 gram dimasukkan dalam bejana dan direndam dalam etanol 70 selama 3 hari sambil diaduk sesekali. Hasil
commit to user
26
maserasi maserat disaring dengan menggunakan kertas saring. Lalu filtrat ekstrak yang didapat dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator hingga
seluruh pelarut terbuang. Apabila ekstrak yang didapat kurang kental atau pekat, ekstrak selanjutnya dapat diuapkan menggunakan waterbath hingga
didapat ekstrak kental. Ekstrak biji buah pepaya kemudian disimpan di dalam lemari es. Diagram alir preparasi sampel dan ekstraksi dapat dilihat pada
gambar 4.
Gambar 4. Preparasi Sampel dan Ekstraksi Biji Buah Pepaya
Biji buah pepaya Dicuci
Dikeringkan Dihaluskan dan diayak dengan
ayakan 4060 mesh Serbuk simplisia biji pepaya
Maserasi dengan etanol 70 selama 3 hari
Disaring Pemisahan pelarut dengan
vacuum rotary evaporator Dipekatkan dengan waterbath
Ekstrak etanol biji buah pepaya
commit to user
27
3. Penyiapan Alat dan Pembuatan Media
Alat yang dipakai adalah alat yang dipinjam dari Laboratorium Biologi Pusat Sub Lab Mikrobiologi UNS dan Laboratorium Teknologi Farmasi
FMIPA UNS. Alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C pada tekanan 1atm selama 15 menit. Media dibuat dengan formulasi sesuai dalam kemasan. Media NA
dibuat dengan cara melarutkan 2 gram NA dalam 100mL akuades. Media NB dibuat dengan cara melarutkan 0,4 gram NB kedalam 50mL akudes. Media
MHA dibuat dengan cara melarutkan 11,4 gram bubuk media MHA dilarutkan dalam 300mL akuades.
Pembuatan media dibantu dengan proses pemanasan untuk mempercepat pelarutan. Selanjutnya media disterilisasi menggunakan
autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C dan tekanan 1 atm.
4. Pengambilan Apusan dan Isolasi Bakteri
Apusan diambil dari plak gigi sukarelawan dengan cara mengusap plak gigi menggunakan cotton budd steril. Apusan plak dilarutkan dalam larutan
garam fisiologis NaCl 0,9 yang kemudian ditanam dan diratakan pada media NA menggunakan metode streak plate dan diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37
o
C. Masing-masing koloni yang tumbuh dipindahkan di media NA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Kemudian tiap-tiap koloni yang telah dipilih diambil 1 ose dipindahkan ke media NA dan diinkubasi.
Diambil 1 mata ose bakteri dan ditanam di media agar miring sebagai stok bakteri untuk dilakukan pengecatan gram dan pengamatan morfologi. Apabila
commit to user
28
hanya terdapat satu jenis bakteri maka langsung dibuat stok bakteri uji. Namun apabila ditemukan lebih dari satu jenis koloni bakteri dalam satu petri
maka terlebih dahulu dilakukan isolasi menggunakan media yang sesuai. Diagram alir pengambilan apusan dan isolasi bakteri dari plak gigi dapat
dilihat pada gambar 5.
Gambar 5. Pengambilan Apusan dan Isolasi Bakteri dari Plak Gigi
Apusan plak gigi
Ditanam di media NA dengan metode spread
Diinkubasi 24 jam pada 37ºC
Diamati koloni yang tumbuh Dilarutkan dalam
larutan NaCl 0,9
Masing-masing koloni dipindah ke media NA
Diinkubasi 24 jam pada 37ºC
Dipindah ke media agar miring Pengecatan Gram dan
pengamatan morfologi
1 koloni bakteri 1 koloni bakteri
Stok bakteri uji Pemisahan
koloni isolasi
commit to user
29
5. Pengecatan Gram
Langkah awal pengecatan gram adalah membersihkan object glass dan degglass dengan alkohol dan diberi label di bagian ujung object glass untuk
membedakan bakteri yang akan dicat. Bagian bawah object glass diberi tanda bulatan berdiameter ± 1cm dengan spidol sebagai daerah pengecatan
bakteri. Pada sisi sebaliknya diteteskan 1 tetes akuades di daerah bulatan kemudian diambil 1 ose biakan bakteri secara aseptis dan diletakkan di daerah
bulatan lalu diratakan. Setelah itu dilakukan proses fiksasi dengan cara melewatkan object
glass diatas nyala api hingga kering. Setelah difiksasi, preparat ditetesi dengan cat gram A dan dibiarkan selama 1-3 menit. Cat gram A dibuang
dengan cara diserap menggunakan tisu kemudian dicuci di bawah air mengalir dan dikeringkan.
Preparat digenangi cat gram B dan dibiarkan selama 1 menit kemudian dicuci dengan air dan dikeringkan. Object glass dimiringkan dan ditetesi cat
gram C selama 30 detik hingga warna hilang kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Preparat digenangi cat gram D dan dibiarkan
selama 2 menit kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
30
Tahap selanjutnya adalah pengamatan preparat di bawah mikroskop. Preparat ditutup dengan degglass yang sebelumnya diberi minyak emersi
selanjutnya diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000x. Sel bakteri diamati bentuk dan warnanya. Sel bakteri berwarna merah muda
menunjukkan bakteri Gram negatif sedangkan sel bakteri berwarna biru-ungu menunjukkan bakteri Gram positif. Diagram alir pengecatan Gram dapat
dilihat pada gambar 6. perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
31
Gambar 6. Pengecatan Gram
diperoleh diamati
Degglass Mikroskop perbesaran kuat
Morfologi bakteri, Gram negatif merah muda, Gram positif biru-ungu
dicuci cepat, dikering-anginkan, ditutup dikering-anginkan, ditetesi
dicuci air, dikering-anginkan, ditetesi dibuang tanpa dicuci air, digenangi
ditetesi diletakkan
1 tetes aqua 1 ose biakan
bakteri diperoleh
digenangi diratakan
Preparat kering dilewatkan
didapat
Cat gram A selama 1-3 menit Bulatan noda
Nyala api Object Glass terbalik
digambar diberi
dibersihkan
dibalik Object
Glass Label
Bulatan diameter ±1cm
Daerah pengecatan mikroba
Alkohol
Cat Gram C selama 30 detik himgga warna hilang
Cat Gram D selama 2 menit Cat Gram B selama 1 menit
commit to user
32
6. Uji Aktivitas Antibakteri
Langkah-langkah pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol biji pepaya adalah sebagai berikut :
a. Penyiapan alat
Alat uji yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC, tekanan 1atm selama 15 menit.
b. Pembuatan stok bakteri uji
Membiakkan bakteri uji yang diambil dari hasil isolasi bakteri plak gigi ke dalam media agar miring atau media yang diperkaya dalam tabung
reaksi yang kemudian diinkubasi pada suhu 35-37ºC selama 24 jam. c.
Pembuatan Suspensi Bakteri Uji Bakteri yang akan diuji disuspensikan dengan cara mengambil 1 mata
ose stok kultur bakteri uji dan menumbuhkannya dalam media NB, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
C dengan shaker. d.
Pembuatan Suspensi CMC-Na 0,1 bv Suspensi CMC-Na 0,1 bv dibuat dengan cara melarutkan 0,05 gram
serbuk CMC-Na dilarutkan dalam 50 ml aquadest. Kemudian disterilisasi. e.
Pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol biji papaya Seri konsentrasi ekstrak etanol biji pepaya dibuat dengan cara
mengambil sejumlah gram ekstrak biji buah pepaya sesuai dengan konsentrasi yang dibuat. Kemudian ekstrak ditambahkan suspensi CMC-
Na 0,1 hingga volume larutan mencapai 2mL. komposisi pembuatan seri konsentrasi ekstrak sebagai berikut :
commit to user
33
Tabel IV. Komposisi Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Biji Buah Pepaya
Konsentrasi Ekstrak gram
CMC-Na 0,1mL ad 2
10 0,2
ad 2 20
0,4 ad 2
30 0,6
ad 2 40
0,8 ad 2
50 1,0
ad 2 60
1,2 ad 2
70 1,4
ad 2 80
1,6 ad 2
90 1,8
ad 2
f. Pembuatan Larutan Kontrol
Kontrol yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri ini terdiri dari kontrol suspensi CMC-Na 0,1 , kontrol etanol 70 serta kontrol
antibiotik Amoksisilin 0,03 . Kontrol amoksisilin dibuat dengan cara melarutkan 0,03 gram dalam 10 mL akuades steril.
g. Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi padat dan tehnik penanaman bakteri menggunakan tehnik pour plate. Tahap
pengujiannya sebagai berikut : 1
Menyiapkan media uji MHA disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit kemudian didinginkan hingga 40°C.
2 Suspensi bakteri uji dicampurkan secara aseptis ke dalam media MHA
yang bersuhu 40°C dengan perbandingan 1:100 bakteri : media kemudian dihomogenkan.
3 Menuang media ke dalam cawan petri sebanyak 15 mL dan dibiarkan
memadat. perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
34
4 Membuat lubang sumuran dengan menggunakan pelubang gabus
dengan diameter lubang sebesar 6 mm pada media padat. 5
Memasukkan 20 µL seri konsentrasi ekstrak dan larutan kontrol ke dalam masing-masing lubang, kemudian diberi label dan diinkubasi
pada suhu 35-37°C selama 24 jam. Masing-masing konsentrasi ekstrak dan larutan kontrol dilakukan replikasi sebanyak 2 kali.
6 Mengukur diameter daya hambat dengan pengukuran dari 3 sisi
tiapmlubang. Kemudian nilai diameter dirata-rata. 7
Membandingkan nilai diameter daya hambat antar bakteri uji. Diagram alir pengujian aktivitas antibakteri dapat dilihat pada gambar 7.
Gambar 7. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Biji Buah Pepaya terhadap Bakteri Hasil Isolasi dari Plak Gigi
Suspensi bakteri Dicampur ke media
MHA bersuhu 40-50ºC Dituang ke petri masing-
masing 15 mL Media memadat
Dibuat lubang sumuran dengan diameter 6mm
Dimasukkan 20 µL seri konsentrasi ekstrak dan larutan kontrol
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC
Replikasi 2 kali Diukur diameter daya hambat
commit to user
35
F. Analisis Hasil
