3. METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Mei 2010 sampai Februari 2011, bertempat di laboratorium Bioindustri Teknologi Industri Pertanian IPB dan
laboratorium SBRC IPB Bogor.
3.2 Bahan dan Alat 3.2.1 Bahan
Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah ubi kayu, S. cerevisiae
berupa ragi curah dari pasar bogor, ragi kering Fermipan™, kultur koleksi PAU ATCC 9763 dan IPB Culture Colection IPBCC 05.548, pupuk NPK, H
2
SO
4
pekat teknis, NH
4
OH 21, media Yeast Malt Glukose Pepton YMGP
3.2.2 Alat
Peralatan utama yang digunakan di dalam penelitian ini antara lain peralatan gelas, neraca analitik, shaker, hemasitometer, autoklaf, pH universal, brix meter,
HPLC, Spektrofotometer UV-Vis, GC, Densitometer, seperangkat alat inokulasi khamir dan seperangkat alat produksi bioetanol skala laboratorium.
3.3 Tahapan Penelitian
Tahapan penelitian adalah: 1 persiapan bahan baku, 2 karakterisasi ubi kayu dan hidrolisat, 3 seleksi, 4 adaptasi S. cerevisiae dan 4 produksi etanol Lampiran
2.
3.3.1 Persiapan Bahan Baku
Bahan baku yang masih segar dipisahkan kulit ari dengan daging umbinya. Setelah kulit ari bersih daging umbi dicuci untuk membuang kotoran yang masih
menempel. Selanjutnya ubi kayu diparut sehingga menjadi bubur ubi kayu.
3.3.2 Karakterisasi Ubi Kayu
Sifat kimia bubur ubi kyu selanjutnya dianalisa dengan analisa proximat Lampiran 3. Parameter yang diukur antara lain komponen air, abu, lemak protein,
serat kasar dan karbohidrat by difference yang ditetapkan menurut metode AOAC
1995, sedangkan pati dan komponen serat diukur menurut metode Van Soetst 1963.
3.3.3 Hidrolisis Asam dan Karakterisasi Hidrolisat
Hidrolisis dalam penelitian ini dilakukan satu tahap menggunakan autoklaf sederhana. Padatan yang digunakan pada saat hidrolisis adalah 18 dengan
konsentasi H
2
SO
4
1M Lampiran 4. Campuran ubi kayu, H
2
SO
4
dan air dihidrolisis selama 15 menit dengan suhu 121
o
C. Setelah dihidrolisis, hidrolisat ditambahkan NH
4
OH teknis 21 untuk menaikkan pH hidrolisat menjadi 4-5. Karakterisasi hidrolisat dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui karakteristik hidrolisat dengan
analisis gula total dengan metode fenol H
2
SO
4
, analisis gula pereduksi dengan metode DNS, furfural dan HMF dengan metode HPLC Lampiran 3.
1.3.4 Seleksi
1.3.4.1 Persiapan Inokulum
Perlakuan pendahuluan untuk kelompok ragi kering seperti ragi curah dan Merk ”F” berbeda dengan S. cerevisiae yang berbentuk biakan segar. Adapun
perlakuan untuk biakan segar adalah sebagai berikut : Sebanyak 1 ose biakan segar dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer yang
berisi 5 ml media YMGP yang telah disterilisasi pada suhu 121
o
C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. yang terdiri dari 5gl ekstrak khamir, 5gl malt, 40gl glukosa, 5gl
pepton dan 1L aquadest, Inkubasi dilakukan pada suhu 30
o
C selama 48 jam dan di shaker Arnata 2009. Setelah dibiakkan jumlah populasi akan dihitung dengan
metode hitung langsung menggunakan hemasitometer. Isolat ragi kering dihitung tanpa proses penyegaran, namun hanya dilakukan pengenceran serial saja sampai 10
- 3
. Kuantitas S. cerevisiae Lampiran 5 yang dimasukkan ke dalam hidrolisat harus seragam untuk menciptakan lingkungan yang homogen.
1.3.4.2 Seleksi Toleransi Galur S. cerevisiae terhadap Hidrolisat Asam
Tujuan penelitian ini adalah untuk menyeleksi beberapa galur S. cerevisiae, yang paling toleran terhadap hidrolisat asam ubi kayu. Sebelum digunakan, hidrolisat
disaring dengan kertas saring dan pompa vakum sehingga terpisah padatan dan cairannya. Cairan tersebut digunakan untuk media fermentasi Martin et al. 2007.
Selanjutnya kedalam hidrolisat ditambahkan masing-masing satu galur S. cerevisiae dengan populasi yang sama. S. cerevisiae kering galur ”F” dijadikan acuan jumlah
galur yang lainnya. Starter 0,23 gula awal dan NPK 0,06 gula awal Arnata 2009 ditambahkan ke dalam hidrolisat. Campuran hidrolisat diinkubasi di dalam labu
erlenmeyer 250 ml menggunakan orbital shaker 128 rpm selama 24 jam pertama. Labu erlenmeyer ditutup dengan sumbat karet dan labu leher angsa secara aseptis.
Total waktu inkubasi selama 72 jam. Pengamatan dilakukan setiap 12 jam terhadap total gula, gula pereduksi, dan etanol yang terbentuk pada akhir fermentasi Lampiran
6. Parameter yang diukur dan dihitung sebagai indikator kinerja proses seleksi
toleransi galur S. cerevisiae terhadap hidrolisat asam adalah : 1. Substrat awal berupa gula total So
2. Sisa substrat setiap 12 jam 3. Kadar etanol sebagai produk P
4. Efisiensi pemakaian substrat S0-SS0 5. Efisiensi fermentasi PP teoritis
6. Rendemen etanol Y
ps
Galur yang toleran adalah galur yang menunjukkan efisiensi pemanfaatan substrat, efisiensi fermentasi dan rendemen etanol Lampiran 6 tertinggi. Galur yang
paling toleran digunakan untuk penelitian selanjutnya.
1.3.4.3 Seleksi Total Gula Awal dan Dosis Starter Terbaik
Pada penetuan ini fermentasi hidrolisat asam ditetapkan kadar gula dan dosis starter minimum yang paling efektif bagi galur terpilih. Keadaan fermentasi sama
seperti seleksi toleransi galur, namun jumlah gula yang dimasukkan adalah 15, 18, 20 dan 24. Dosis starter yang dimasukkan adalah 1x, 2x dan 3x 0,23 gula
awal. Pengamatan yang dilakukan adalah jumlah total gula pada awal dan akhir fermentasi, serta etanol yang terbentuk pada akhir fermentasi.
Parameter yang diukur dan dihitung sebagai indikator kinerja proses seleksi total gula awal dan dosis starter terbaik adalah :
1. Substrat awal berupa gula total So
