commit to user
Bagian Pulmonologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi FK UNS RSUD Dr.Moewardi, 2012
40 Menurut Gay dan Diehl 1992;146 dalam Suhardi Sigit 1999;70
dikutip dari 58
menyatakan bahwa besar sampel harus besar , pada umumnya semakin besar sampel cenderung semakin representatif, hasil penelitian dapat lebih digeneralisasikan. Besar
sampel menurut Gay dan Diehl juga tergantung dari jenis penelitian. Jenis penelitian dan sampel minimum yang disarankan sebagai berikut.
Penelitian deskriptif 100 subyek Penelitian korelasional 50 subyek
Penelitian kausal-perbandingan 30 subyek per grup Penelitian eksperimen 30 subyek per grup
Berdasar pernyataan di atas maka penelitian ini mengambil sampel 30 subyek tiap kelompok.
3.6. CARA KERJA PENELITIAN
Subyek penelitian adalah pasien yang terdiagnosis TB paru kasus baru dan belum mendapat terapi obat antituberkulosis di RS Dr Moewardi Surakarta dan
pelayanan kesehatan jejaring diminta persetujuan penelitian. Sebelum mendapatkan terapi obat antituberkulosis pasien diambill darah venanya untuk diperiksa kadar
glutathione total, serum AST, dan ALT. Setelah mendapatkan hasil pemeriksaan
tersebut dan pasien memenuhi syarat untuk mendapat terapi obat antituberkulosis, pasien dipisahkan secara acak menjadi dua kelompok. Kelompok kontrol mendapatkan
regimen obat antituberkulosis rifampisin 10 mgkgBBhari, isoniazid 5 mgkgBBhari, pirazinamid 25 mgkgBBhari, etambutol 15 mgkgBBhari dan kelompok perlakuan
mendapatkan regimen dan dosis yang sama ditambah NAC oral 600 mg dua kali sehari. Obat antituberkulosis pada kelompok perlakuan diminum bersamaan dengan NAC. Dua
minggu 14 hari kemudian pasien kembali diperiksa kadar glutathione total, serum AST, dan ALT.
commit to user
Bagian Pulmonologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi FK UNS RSUD Dr.Moewardi, 2012
41
3.7. ALUR PENELITIAN
Penderita TB Kriteria inklusieksklusi Anamnesis
Pemeriksaan fisik Foto toraks, sputum
TB paru BTA +- Penjelasan
Penawaran Persetujuaninform consent
Tidak setuju Setuju Memenuhi kriteria inklusi
eksklusi
analisis statistik TB paru + OAT ktgr I TB paru + OAT ktgr I+ NAC analisis
statistik 14 hari 14 hari
Analisis statistik Cek glutathione
AST, ALT
Cek glutathione AST, ALT
Cek glutathione AST, ALT
commit to user
Bagian Pulmonologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi FK UNS RSUD Dr.Moewardi, 2012
42
3.8. TEKNIK PEMERIKSAAN
Berikut ini adalah teknik pemeriksaan kadar glutathione total, serum AST, dan serum ALT.
Pemeriksaan kadar glutathione
59
Prinsip kerja: Metoda yang berdasarkan pada pembentukan chromophoric thione. Penyerapan
diukur pada 420 nm dibandingkan langsung dengan konsentrasi GSH. Terdapat tiga tingkat reaksi. Pertama larutan buffer dan pereduksi, tris 2-carboxyethylphosphine
TCEP, ditambahkan ke sejumlah glutathione teroksidasi GSSG menjadi keadaan tereduksi
GSH. Chromogen,
4-chloro-1-methyl-7-trifluoromethylquinolinium methylsulfate, ditambahkan membentuk thioethers dengan semua thiol yang ada di
dalam sampel, adalah reaksi ke dua. Penambahan basa untuk mencapai pH diatas 13, suatu β-eliminasi spesifik untuk GSH-thioether yang dihasilkan di dalam chromophoric
thione , adalah reaksi ke tiga.
Bahan reagen: ·
Chromogen : 1-methyl-4-chloro-7-trifluoromethylquinolinium methylsulfate
dalam 20 mL HCl ·
Pengembang warna : NaOH dalam 20 mL air ·
Agen pereduksi : Tris2-carboxyethylphosphine TCEP dalam 20 mL HCl ·
Reagen presipitasi : Trichloroacetic acid TCA dalam 25 mL air ·
Buffer : potassium phosphate, diethylenetriaminepentaacetic acid
DTPA, Lubrol pH 7,8, 20 mL Tahap-tahap pemeriksaan:
1. Masukkan darah 0,5 mL ke dalam tabung berisi antikoagulan dan campur
dengan dibolak-balik 2.
Tambahkan 100µ L lysate ke dalam tabung microcentrifuge 3.
Tambahkan 300µL reagen presipitasi ke dalam tabung 4.
Putar-putar sekitar 15 menit
commit to user
Bagian Pulmonologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi FK UNS RSUD Dr.Moewardi, 2012
43 5.
Centrifuge pada 10.000
ɡ dalam 5 menit pada suhu ruangan 6.
Kumpulkan supernatant untuk pengukuran.
Pemeriksaan serum AST
60
Prinsip kerja: Α-ketoglutarat + L-aspartat L-glutamat + oksaloasetat
Enzim AST mengkatalisis keseimbangan reaksi tersebut. Peningkatan oksaloasetat diukur dengan reaksi indikator yang dikatalisis oleh malate dehidrogenase.
Oksaloasetat + NADH + H
+
L-malate + NAD
+
Nicotinamide adenine dinucleotide tereduksi NADH dioksidasi menjadi nicotinamide
adenine dinucleotide NAD
+
. Kecepatan secara fotometri yang mengukur penurunan NADH sebanding dengan kecepatan pembentukan oksaloasetat dan juga aktivitas AST.
Metode : spectrophotometry Jenis sampel : plasma heparin
Volume : 50-100 µL Bahan reagen:
Botol 1: ·
Tris buffer, pH 7,8 100 mmolL ·
L-aspartate 300 mmolL ·
NADH ragi 0,23 mmolL ·
MDH ≥ 0,53 UmL 8,83 µkatL
· LDH mikroorganisme
≥ 0,75 UmL 12,5 µkatL Botol 2:
Α-ketoglutarat 75 mmolL
AST
MDH
commit to user
Bagian Pulmonologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi FK UNS RSUD Dr.Moewardi, 2012
44 Tahap pemeriksaan:
Pertama dilakukan proses quality control dengan menggunakan larutan pengontrol. Spektrofotometer digunaklan bila hasil AST berada pada interval 25,3 –
40,5 UL, selanjutnya dilakukan pemeriksaan AST. Larutan reagen 1000 µL ditambah plasma heparin sebanyak 100 µL. Dilakukan inkubasi pada suhu 37
˚C selama satu menit. Kemudian campuran plasma dan reagen dimasukkan ke alat penghisap di
spektrofotometer yang telah diprogram untuk pemeriksaan AST.
Pemeriksaan serum ALT
61
Prinsip kerja: α-ketoglutarat + L-alanin L-glutamat + piruvat
Enzim ALT mengkatalisis keseimbangan reaksi. Peningkatan piruvat diukurkan dengan reaksi indikator yang dikatalisis oleh laktat dehidrogenase.
Piruvat + NADH + H
+
L-laktat + NAD Oksidasi NADH menjadi NAD
+
terjadi pada reaksi kedua. Kecepatan penurunan NADH yang diukur secara fotometri sebanding dengan kecepatan pembentukan piruvat
dan aktivitas ALT. Metode : spectrophotometry
Jenis sampel : plasma heparin Volume : 50-100 µ L
Bahan reagen: Botol 1:
· Tris buffer
pH 7,3 125 mmolL ·
L-alanin 625 mmolL ·
NADH ragi 0,23 mmolL ·
LDH mikroorganisme ≥ 1,5 UmL 25 µkatL
ALT
LDH
commit to user
Bagian Pulmonologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi FK UNS RSUD Dr.Moewardi, 2012
45 Botol 2:
α-ketoglutarat 94 mmolL
Tahap pemeriksaan: Pertama kali dilakukan quality control dengan larutan pengontrol.
Spektrofotometer digunakan bila ALT berada di interval 17,6 – 28,2 UL. Kemudian dilakukan pemeriksaan ALT. Larutan reagen sebanyak 1000 µ L ditambah plasma
heparin sebanyak 100 µ L. Dilakukan inkubasi pada suhu 37 ˚C selama satu menit.
Kemudian campuran plasma dan reagen dimasukkan ke alat penghisap di spektrofotometer yang telah diprogram untuk pemeriksaan ALT.
3.9. ANALISIS DATA