3.4. Pembuatan Larutan Pereaksi 3.4.1. Pereaksi Libermann-Burchad Harborne, 1987
Sebanyak 20 ml asam asetat anhidrat dicampur dengan 1 ml asam sulfat pekat dan 50 ml kloroform. Larutan ini harus dibuat baru.
3.5. Pembuatan Plat Kromatografi Lapis Tipis
Sebanyak 30 g silika gel GF
254
dimasukkan ke dalam lumpang porselen kering, ditambahkan 40 ml air suling, mula-mula diaduk perlahan-lahan dengan
alu sampai didapat suspensi yang seragam tanpa terjadi gelembung udara ataupun gumpalan. Selanjtutnya ditambahkan air suling sebanyak 20 ml sambil diaduk.
Jangka waktu untuk memperoleh suspensi yang dapat disaputkan tidak boleh melebihi sembilan puluh detik, kemudian suspensi segera dituanglan ke plat kaca.
Plat yang sudah dilapisi dibiarkan kering. Kemudian diaktifkan dalam oven pada suhu 110
C selama 30 menit dengan posisi tegak dalam rak pengering. Plat disimpan ditempat yang tidak lembab dan bebas uap laboratorium Stahl, 1985.
3.6. Analisis Ekstrak n-Heksana secara Kromatografi Lapis Tipis KLT
Ekstrak n-heksana dianalisis secara KLT menggunakan plat pra lapis tipis silika gel GF
254
Ekstrak n-heksana ditotolkan pada plat pra lapis tipis silika gel GF , fase gerak campuran n-heksana :etil asetat dengan perbandingan
90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, penampak bercak adalah pereaksi Libermann-Burchard.
Cara kerja :
254
,ke dalam bejana yang telah jenuh dengan uap fase gerak dan ditutup rapat. Setelah
Universitas Sumatera Utara
elusi selesai plat dikeluarkan dari bejana dan diamati secara visual, lalu disemprot dengan pereaksi Libermann-Burchard, plat dipanaskan di oven pada suhu 85-95
Seperangkat alat kromatografi kolom dipasang, kemudian ke dalam dasar kolom dimasukkan kapas yang telah dicuci dengan metanol dan dikeringkan
sebagai filter. Silika gel disuspensikan dengan fase gerak n-heksana, diaduk sampai homogen dan dimasukkan ke dalam kolom yang telah diisi dengan fase
gerak yang sama sambil dinding kolom diketuk-ketuk untuk menghilangkan gelembung udara dan dialiri dengan fase gerak sampai memadat. Kolom yang
sudah dikemas dibiarkan selama 24 jam, kemudian kolom dibuka sampai genangan pelarut sama dengan tinggi silika gel. Ekstrak n-heksana dilarutkan
dengan sedikit fase gerak lalu dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan-lahan. Setelah sampel turun, lalu melalui dinding kolom secara perlahan-lahan dialirkan
fase gerak dengan menggunakan pipet tetes sambil kran kolom dibuka. Atur tetesan yang keluar sama dengan tetesan pelarut dari reservoir. Hasil elusi masing-
msing ditampung 5 ml dalam vial yang telah diberi nomor dan elusi dihentikan C
selama 15 menit, diamati kembali warna bercak dan dihitung harga Rf. Hasil kromatogram dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 35.
3.7. Isolasi Ekstrak Dengan Kromatografi Kolom
Ekstrak n-heksana di kromatografi kolom menggunakan pelarut landaian n-heksana – etilasetat dengan perbandingan 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40,
50:50, dan fase diam silika gel 60 ukuran partikel 0,063-0,200 mesh 70-230 ASTM
Cara kerja:
Universitas Sumatera Utara
setelah vial terakhir memberikan hasil negatif terhadap pereaksi Libermann- Burchad. Selanjutnya di KLT dan pola kromatogram yang sama hasilnya
digabungkan menjadi satu fraksi. Kromatogram hasil kromatografi kolom dapat dilihat pada lampiran 6 da 7 halaman 37 dan 38, kromatogram hasil
penggabungan fraksi dapat dilihat pada lampiran 8 halaman 39 dan harga Rf penggabungan fraksi dapat dilihat pada lampiran 9 halaman 40.
3.8. Pemisahan Senyawa TriterpenoidaSteroida dari Fraksi F2 dengan KLT Preparatif serta Pemurnian Kristal F2
Kristal F2 hasil kromatografi kolom dikromatografi lapis tipis preparatif menggunakan fase diam silika gel GF
254,
fase gerak n-heksana - etilasetat 70:30 dan penampak bercak pereaksi Liebermann - Burchard.
Cara kerja : Terhadap F2 ditotolkan berupa pita pada plat KLT berukuran 20 x 20 cm
lalu dimasukkan kedalam bejana yang telah jenuh dengan uap fase gerak. Setelah elusi selesai plat dikeluarkan terhadap pereaksi dari bejana dan dikeringkan
kemudian bagian samping plat disemprot dengan pereaksi Liebermann - Burchard lalu dipanaskan dengan bantuan hair dryer. Bagian plat silika gel yang
memberikan harga Rf sama dengan noda yang positif terhadap pereaksi Liebermann - Burchard dikerok kemudian dilarutkan dengan pelarut metanol,
filtrat kemudian dimasukkan kedalam lemari pendingin sampai terbentuk kristal. Larutan dipisahkan dari kristal yang terbentuk dan dicuci kembali berulang kali
dengan metanol dingin hingga diperoleh kristal murni. Kromatogram hasil KLT preparatif dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 41.
Universitas Sumatera Utara
3.9. Uji Kemurnian Terhadap Kristal Hasil Ioslasi F2 Dengan KLT 2 Arah
