Pelaksanaan Penelitian BAHAN DAN METODE

diisolasi. Hal ini dilakukan agar mikrob yang akan diteliti berada pada kondisi dorman sehingga tidak mendapat gangguan dengan perubahan lingkungan di sekitarnya. 1.2 Pengambilan Sampel Daun Pengambilan sampel daun dilakukan untuk mengetahui status hara pada tanaman. Contoh daun diambil dari tiga tingkat tajuk tajuk bagian bawah, tengah, dan atas yang menghadap barat dan timur. Pengambilan sampel daun dilakukan hanya pada tajuk yang menghadap barat dan timur dikarenakan area ini mendapatkan penyinaran yang intensif, sehingga bisa berfotosintesis dengan maksimal. Sampel daun yang diambil dari setiap lokasi dimasukkan ke dalam amplop kertas. Amplop kertas digunakan karena kertas ini bisa menyerap air, sehingga daun tidak busuk sebelum dianalisis. 2. Analisis Kimia Analisis kimia yang dilakukan berupa analisis hara tanaman melalui daun. Analisis hara dilakukan karena kandungan hara dalam tanaman dapat mempengaruhi kesehatan dan daya tahan tanaman terhadap infeksi mikrob. Adapun hara tanaman yang dianalisis adalah: N, P, K, Ca, Mg, Mn, Cu, Zn, dan Fe. Analisis kandungan Nitrogen pada jaringan daun dilakukan dengan menggunakan metode semi mikro Kjeldal, sedangkan delapan unsur hara yang lain dianalisis menggunakan metode pengabuan basah. Analisis nitrogen menggunakan bagian daun dengan bobot 0,5 gram ditambah 5 ml H 2 SO 4 dan H 2 O 2 , kemudian didestruksi selama 1.5 jam. Sampel yang telah didestruksi selama 1.5 jam didinginkan sampai uapnya hilang dan ditambahkan H 2 O 2 1 ml kemudian didestruksi lagi selama 30 menit. Warna hasil ekstraksi yang semula berwarna kuning sampai hitam menjadi bening atau putih susu. Ekstrak tanaman hasil destruksi diambil 20 ml untuk didestilasi dengan 20 ml NaOH 50 dan 100 ml aquades. Uap cairan ditampung dengan 10 ml H 3 BO 3 4 dan indikator, destilat yang dihasilkan dititrasi dengan HCl 0,0995 N untuk menetapkan kandungan nitrogen. Hasil destruksi daun akan digunakan untuk menentukan status hara tanaman. kandungan fosfor P diukur dengan Spectrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 660 nm, kandungan Ca, Mg, Mn, Cu, Zn, dan Fe diukur dengan AAS, sedangkan kandungan kalium K diukur dengan Flamefotometer. 3. Analisis Biologi Analisis biologi dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya peran mikrob dan efektivitasnya terhadap pembentukan gaharu pada A. malaccensis. Tahapan dari analisis biologi adalah: 3.1 Isolasi Mikrob Mikrob yang diisolasi dari pohon A. malaccensis adalah fungi dan bakteri. Isolasi dilakukan di laboratorium Bioteknologi Tanah Institut Pertanian Bogor. Isolasi dilakukan dengan menggunakan media PDA untuk isolasi fungi dan TSA 5 untuk isolasi bakteri. Isolasi fungi dan bakteri dilakukan dengan metode agar tuang. Langkah awal metode dilakukan dengan menimbang 10 gram sampel, memasukkan sampel ke dalam erlenmeyer berisi 90 ml larutan fisiologis. Sampel yang sudah direndam kemudian dikocok dengan kecepatan 150 rpm. Suspensi yang telah dikocok diambil 1 ml menggunakan pipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan fisiologis, sehingga didapat suspensi dengan seri pengenceran 10 -2 . Langkah yang sama dilakukan untuk membuat seri pengenceran 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 , dan 10 -9 . Dari setiap seri pengenceran diambil 1 ml suspensi dan ditumbuhkan pada medium. Isolasi fungi dilakukan pada pengenceran 10 -2 sampai 10 -5 , sedangkan bakteri di isolasi dari pengenceran 10 -7 sampai 10 -9 . 3.2 Pemurnian Pemurnian dilakukan untuk mendapatkan biakan murni yang diinginkan tanpa ada kontaminan dari mikrob lain. Pemurnian dilakukan dengan memindahkan mikrob hasil isolasi dari media tumbuh awal ke media biakan yang baru. Koloni fungi dan bakteri dengan penampakan berbeda dipindahkan ke petri terpisah. Pemindahan mikrob dilakukan dengan menggunakan jarum ose yang sebelumnya dipanaskan pada api bunsen. Pada bakteri, pemurnian dilakukan dengan metode gores, sedangkan pada fungi dilakukan dengan metode titik. Hal ini dilakukan karena miselium fungi akan hancur jika sama-sama menggunakan metode gores. 3.3 Uji Fisiologis Mikrob yang sudah murni dilakukan pengujian fisiologis berupa uji pelarutan selulosa dan pektin. Hal ini dilakukan untuk mengetahui efektivitas mikrob dalam melarutkan selulosa dan pektin. Untuk uji selulosa digunakan media CMC, sementara pengujian pektin menggunakan media Citric pectin 0.5 untuk fungi dan Pectinolytic Bacteri untuk bakteri. Pada dasarnya uji pelarutan selulosa dan pektin sama, hanya medianya saja yang membedakan. Uji pelarutan selulosa dan pektin dilakukan dengan menumbuhkan mikrob pada media selektif dan diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruangan. Mikrob yang telah diinkubasi dilakukan pewarnaan dengan menggunakan Congo red untuk uji pelarutan selulosa dan Kalium iodine untuk pelarutan pektin. Pembentukan zona bening di sekitar biakan merupakan indikasi bahwa mikrob tersebut bisa melarutkan selulosa dan pektin. Indeks selulolitik dan pektinolitik dihitung dengan rumus: 3.4 Seleksi Isolat Seleksi isolat dilakukan untuk mendapatkan isolat terbaik dan efektif untuk merangsang pembentukan gaharu. Isolat diseleksi berdasarkan indeks pelarutan selulosa dan pektin. Isolat yang dipilih adalah isolat yang mempunyai indeks pelarutan tinggi. 4. Pengujian Lapang Pengujian lapang dilakukan untuk mengetahui efektivitas mikrob yang telah diisolasi dalam menghasilkan gaharu pada A. malaccensis. Pengujian lapang dilakukan dengan tiga tahapan, yaitu: 1. Pembuatan inokulan Isolat yang terseleksi dibuat inokulan cair dengan cara menumbuhkan isolat tersebut pada media Nutrient Broth. 2. Inokulasi Inokulan yang telah dibuat diinokulasikan pada pohon A. malaccensis di Rantau Rasau, Kabupaten Tanjung Jabung Timur, Provinsi Jambi. Inokulasi dilakukan dengan cara menginjeksikan inokulan pada pohon yang telah dibor. Pengeboran dilakukan dengan posisi miring ke bawah dengan pola berbentuk spiral mengelilingi batang . Gambar 1. Pola Spiral Inokulasi Pohon Gaharu Dalam satu pohon terdapat lima lubang injeksi. Setiap isolat diberikan ulangan sebanyak tiga pohon, jadi total setiap isolat terdapat 15 titik pengamatan. Setiap lubang di injeksi inokulan sebanyak 1 – 2 ml, kemudian ditutup dengan kapas. sumber: http:kayugaru.files.wordpress.com2009063.jpg 3. Pengamatan hasil inokulasi Pengamatan dilakukan dengan cara melihat ada tidaknya perubahan warna kayu di sekitar lubang inokulasi. Inokulasi dinyatakan berhasil apabila pada titik lubang bor terdapat tanda terjadinya perubahan warna kayu menjadi coklat hingga hitam dan tergambar dengan tanda laju infeksi patogen serta pengerasan kayu yang telah berisikan resin gaharu. Gambar 2. Bagan Alir Metodologi Penelitian Pengambilan sampel gaharu dan daun Analisis kimia: analisis kandungan hara tanaman Analisis Biologi:  Isolasi bakteri dan fungi  Uji pelarutan Selulosa dan Pektin Seleksi mikrob berdasarkan indeks pelarutan Pembuatan inokulan cair dari isolat terpilih Inokulasi isolat terpilih Pengamatan hasil inokulasi

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi dan Seleksi Mikrob pada A. malaccensis

Populasi bakteri dan fungi diketahui dari hasil isolasi dari pohon yang sudah menghasilkan gaharu. Sampel yang diambil merupakan gaharu yang terbentuk dari gigitan tupai, fungi yang menempel pada batang, pemangkasan dahan dan pelukaan akar. Hasil isolasi total mikrob pada beberapa pohon A. malaccensis disajikan pada tabel di bawah ini. Tabel 1. Populasi Mikrob pada Beberapa Pohon A. malaccensis Kode Pohon Fungi Bakteri SPKgram BKM G1 0.54 x 10 4 11.97 x 10 7 G2 6.87 x 10 4 1.28 x 10 7 G3 5.34 x 10 4 0.30 x 10 7 G4 1.86 x 10 4 7.06 x 10 7 G5 0.46 x 10 4 3.00 x 10 7 G6 0.02 x 10 4 13.53 x 10 7 Rata-rata 3 x10 4

6.19 x 10

7 Berdasarkan hasil isolasi yang dilakukan dari ke enam sampel, diketahui populasi fungi paling banyak ada pada G2. Populasi bakteri terbanyak didapat pada sampel G6. Pada sampel yang sama, dapat diketahui juga bahwa populasi fungi lebih rendah dibanding yang lain. Sampel G3 mempunyai populasi bakteri terendah dibandingkan ke lima sampel yang lain. Populasi mikrob terbanyak bakteri dan fungi pada A. malaccensis G2 dan G6 terdapat pada bagian dahan pohon dan gaharu terbentuk secara alami. Pada sampel dengan populasi bakteri paling rendah G3 gaharu terbentuk dari proses pemangkasan dahan. Populasi mikrob dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, seperti: suhu, kelembaban, pH, ketersediaan oksigen, cahaya, dan tekanan osmotik. Faktor lingkungan yang berperan penting terhadap jumlah populasi mikrob pada beberapa pohon A. malaccensis adalah cahaya. Zabel Morrel 1992 menyatakan, secara umum cahaya berbahaya untuk pertumbuhan vegetatif mikrob perusak kayu dan menyebabkan berkurangnya tingkat pertumbuhan mikrob. Hal ini kemungkinan disebabkan efek dari intensitas radiasi ultraviolet UV yang tinggi. Pernyataan Zabel Morrel 1992 menjelaskan kondisi yang terjadi pada G2, G3, dan G6. Meskipun ketiganya diambil dari bagian dahan pohon, tapi G3 memiliki total populasi bakteri paling sedikit dibanding pohon lain 0.30 x 10 7 . Banyaknya populasi fungi pada G2 6.87 x 10 4 dan bakteri pada G6 13.53 x 10 7 dikarenakan sampel G2 dan G6 tertutupi oleh kanopi. Tutupan kanopi membuat mikrob terlindung dari radiasi UV dan menjaga kelembaban sehingga mikrob bisa tumbuh dengan baik. Kanopi juga menyediakan banyak oksigen dari hasil fotosintesis yang dibutuhkan organisme aerob. Sedikitnya populasi bakteri pada G3 dikarenakan gaharu yang terbentuk berasal dari pemangkasan dahan, sehingga sampel tidak mendapatkan perlindungan dari radiasi matahari. Selain itu, pemangkasan dahan menyebabkan nutrisi pada tanaman berkurang karena tidak mendapatkan nutrisi yang merupakan hasil fotosintesis. Ketersediaan nutrisi yang sedikit menyebabkan pertumbuhan bakteri terhambat dan populasi lebih sedikit dari yang lain. Keadaan yang terjadi pada G6 mengindikasikan adanya kompetisi antara bakteri dan fungi. Madigan et al. 2009 mengungkapkan kompetisi di antara mikrob dipengaruhi oleh tingkat penyerapan nutrisi, tingkat metabolisme, dan tingkat pertumbuhan. Bakteri memiliki tingkat pertumbuhan lebih cepat dibanding fungi karena penyerepan nutrisinya lebih tinggi. Terbatasnya nutrisi yang didapat oleh fungi menyebabkan rendahnya populasi fungi yang ada pada G6. Hasil penelitian Sumarna 2008 menunjukkan suhu udara Kecamatan Tabir Ulu, Kabupaten Merangin, Provinsi Jambi berkisar antara 20 – 33 o C. Suhu pada lokasi penelitian menunjukkan bahwa mikrob yang ada termasuk ke dalam kelompok mesofil mikrob yang hidup pada kisaran suhu 8 – 48 o C. Zabel Morrel 1992 mengemukakan bahwa suhu memberikan efek langsung terhadap aktivitas metabolisme mikrob. Reaksi metabolisme akan meningkat seiring dengan peningkatan suhu sampai batas tertentu.